Aislamiento y cultivo celular

El estudio con muestras de MO y cartílago humanos, fue aprobado por el Comité Autonómico de Ética de la Investigación de Galicia (CAEIG) y cada donante incorporado en este estudio firmó el consentimiento informado (ANEXO I). Las muestras de MO procedieron del Servicio de Reumatología del Complexo Hospitalario Universitario da Coruña (CHUAC). Los donantes no fueron seleccionados y las muestras se procesaron por orden de entrada al laboratorio.

El estudio con muestras de MO y cartílago ovinos, fue aprobado por el Comité Ético de Experimentación Animal del CHUAC (ANEXO II).

Las CMEs de tejido adiposo (CMEs-TA) e iPS, fueron proporcionadas por el grupo del Dr. Ángel Raya, Stem Cell of Pluripotency, del Instituto de Bioingeniería de Cataluña (IBEC).

3.1.1. Aislamiento y cultivo de las células procedentes de la médula ósea humana

Las muestras de MO utilizadas para aislar las CMEs humanas fueron obtenidas de 24 pacientes (media de edad 73 ± 5 años) que se sometieron a cirugía de reposición debido a OA o a fractura. El conjunto celular fue extraído mediante lavados de la MO (Figura 9 A) inyectando, con una jeringa de 20 ml (Kendall, Turquía) y una aguja de bisel ancho BD MicrolanceTM (BD Medical, EE.UU.), medio de Eagle con modificación de Dulbecco (DMEM, Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium; Lonza, España) con un 5% de suero bovino fetal (SBF;

LabClinics, España) y con 1% de penicilina/estreptomicina (P/E; Gibco-

ThermoFisher Scientific, España) (DMEM5%). El medio obtenido, con las células en suspensión, se hizo pasar por un filtro de nylon de 41μm de tamaño

de poro (Millipore, Irlanda) (Figura 9 B). El filtrado se centrifugó durante 10 min a 300xg, se eliminó el sobrenadante y el precipitado celular (Figura 9 C) se resuspendió en DMEM al 20% de SBF con 1% P/E (DMEM20%).

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Figura 9. Extracción de células de la MO de la cabeza femoral humana. A) Lavado de la MO mediante inyecciones con medio. B) Filtrado de la suspensión obtenida. C) El precipitado celular obtenido tras la centrifugación del filtrado.

Las células aisladas se cultivaron en DMEM20%, en frascos de cultivo adherentes (Costar Corning Inc., EE.UU.), a 37ºC en una atmósfera húmeda al 5% de CO2. Tras 48 h, se realizó un lavado con suero salino (Fresenius Kabi,

España) para eliminar las células no adherentes y se reemplazó el medio de cultivo. Cuando las células alcanzaron un 80% de confluencia, se realizaron subcultivos celulares mediante disociación con tripsina-ácido etilen diamino tetraacético (EDTA, Ethylene diamine tetraacetic acid; Sigma-Aldrich, España). En los dos primeros subcultivos celulares se realizó la técnica de pre-plating

(Richler y Yaffe, 1970), que consiste en inactivar la tripsina con suero y esperar a que fibroblastos y macrófagos, con mayor capacidad de adherencia que las CMEs, se adhieran al fondo del frasco de cultivo. Tras 15 min, se recogió la suspensión, se centrifugó 10 min a 300xg y se resembró el precipitado en

DMEM20%.

3.1.2. Aislamiento y cultivo de células procedentes de la médula ósea ovina

Los aspirados de cresta ilíaca, procedentes de seis especímenes de oveja doméstica (Ovis Aries), se obtuvieron con una aguja para biopsias de MO (Ranfac, EE.UU.) y se depositaron en tubos Falcon de 50 ml (Costar Corning Inc.) (Figura 10 A).

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Figura 10. Extracción de células del aspirado de médula ovina. A) Aspirado de cresta ilíaca. B y C) El coágulo del aspirado de médula se troceó y esparció sobre una placa adherente.

Al aspirado de médula se le añadió DMEM5% y se centrifugó durante 10 min a 300xg. Se descartó el sobrenadante y el coágulo formado se troceó con unas pinzas sobre una placa adherente de cultivo (Costar Corning Inc.) (Figura 10 B y C). Se le añadió DMEM20% a los coágulos y se cultivaron a 37ºC en una atmósfera húmeda al 5% de CO2. Tras 48 h, las placas se lavaron con suero

salino para eliminar las células no adherentes y los coágulos. Se realizaron cambios de medio cada 3-4 días. Cuando la confluencia celular se aproximó al 80% se realizó la técnica de pre-plating y las células se subcultivaron.

3.1.3. Aislamiento y cultivo de células derivadas de células pluripotentes inducidas

Las CMEs-TA se mantuvieron en medio para EBs (mEBs), consistente en medio de Dulbecco modificado de Eagle de knockout (KO-DMEM, KnockOut- Dulbecco’s modified Eagle medium; Gibco) con 10% de SBF (Hyclone-GE Healthcare, EE.UU.), 2 mM GlutamaxTM (Glx, Gibco), 50 mM 2-beta- mercaptoetanol (Gibco), 1% aminoácidos no esenciales (NEAA, non-essential amino acids; Gibco) y 1% P/E.

Las iPS se cultivaron en medio para ESCs (mESCs) consistente en KO-DMEM

con 20% suero KnockOut (KO-SR, Gibco), 2mM Glx, 50 mM 2-beta- mercaptoetanol, 1% NEAA, 1% P/E y 10 ng/ml bFGF (Peprotech, EE.UU.). Los cultivos de iPS se mantuvieron sobre una capa de fibroblastos irradiados, a

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modo de células alimentadoras (feeders) (Figura 11 A), a 37ºC al 5% CO2, con

cambios de medio diarios. En dos pases diferentes, las colonias se levantaron manualmente y se adaptaron (es decir, se crecieron sin feeders) a placas recubiertas de MatrigelTM (BD Biosciences, EE.UU.) (Figura 11 B), con medio condicionado obtenido del sobrenadante del cultivo de fibroblastos embrionarios de ratón en mESCs, con 10 ng/ml de bFGF.

Figura 11. Derivación de iPS hacia células similares a CMEs (CSMEs). A) Colonias de iPS sobre feeders. B) Colonias de iPS adaptadas a Matrigel. C) Grupos de EBs sembrados en conjunto para diferenciar hacia CSMEs no clonales (NC-CSMEs). D) EBs sembrados de forma independiente para diferenciar hacia CSMEs pseudo-clonales (C-CSMEs).

Las colonias pluripotentes sembradas en placas de MatrigelTM se disociaron y se centrifugaron 10 min a 800xg, en placas de 96 pocillos con fondo en “V” (Costar Corning Inc.), para la formación de EBs. Tras 24 h, los EBs se cultivaron en mEBs en placas de cultivo no adherentes (Costar Corning Inc.) para formar agregados. Los EBs, tras dos días en suspensión, se sembraron en placas de seis pocillos (Costar Corning Inc.) recubiertas con EmbryoMax®

(Millipore); se cultivaron hasta que las células proliferaron de los EBs (Figura 11 C) y alcanzaron la confluencia. Las células se subcultivaron para obtener una monocapa homogénea de células similares a CMEs (CSMEs), en este caso no- clonales (NC-CSMEs).

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Para evitar problemas debido a la heterogeneidad celular, se estableció un método de derivación, en el cual cada EB se sembró de forma independiente (Figura 11 D) en pocillos de una placa de 24 pocillos (Costar Corning Inc.) recubiertos de EmbryoMax®. Cada EB se expandió clonalmente hasta obtener una monocapa homogénea de CSMEs pseudo-clonales (C-CSMEs).