RESULTADOS Y DISCUSIÓN
III. Aislamiento y purificación de cianobacterias
Al realizar el análisis de la diversidad bacteriana por FISH, se observó la presencia de cianobacterias filamentosas en hepatopáncreas e intestino de camarón como ya se mencionó anteriormente.
Las cianobacterias tienen la capacidad de producir una gran cantidad de metabolitos secundarios tales como hormonas, vitaminas y antibióticos, entre otros (Whitton y Malcolm, 2000). Surgiendo la idea de que posiblemente las cianobacterias estuvieran dominando el nicho ecológico por la liberación de antimicrobianos.
En observaciones realizadas en el sitio de muestreo, los camarones se alimentaban en un 30% de cianobacterias, estos mostraban una pigmentación verde en su cutícula y tracto digestivo (datos proporcionados por los trabajadores de la granja). Además de no mostrar problemas patológicos en todo el desarrollo del cultivo, lo que sugiere la posibilidad de que las cianobacterias estuvieran realizando una función probiótica en el camarón. Por lo antes mencionado surgió el interés por identificar a este microorganismo.
Así, se aisló una cianobacteria filamentosa de hepatopáncreas de camarón, a partir del estanque 6 del segundo muestreo y se obtuvo un cultivo unicianobacterial. En la figura 11, se muestra la separación de filamentos por fototactismo, en placa de agar y los filamentos de cultivos unicianobacteriales.
Figura 11. Observación microscópica de cianobacterias filamentosas aisladas de hepatopáncreas de camarón, estanque 6, segundo muestreo: A) Separación de filamentos por fototactismo, microscopía de campo claro utilizando el objetivo 40X, B) Preparación de filamentos aislados, microscopia de campo claro utilizando el objetivo 100 X.
III.1. Identificación morfológica
La cianobacteria aislada se trató de identificar basándose en su estructura morfológica, utilizando los manuales de clasificación (Rippka, 1988) y con apoyo de la Dra. Elizabeth Ponce (comunicación personal), ya que cuenta con un catálogo de cianobacterias ya identificadas, que fueron aisladas del mismo lugar. Las comparaciones realizadas no mostraron similitud alguna.
III.2. Identificación molecular
Se obtuvo DNA de cianobacterias del hepatopáncreas del estanque 6, del segundo muestreo y del cultivo puro. Se amplificó el DNA de cada muestra utilizando los oligonucleótidos ARNr 23S y cianol16Sfin (Torres-Ariño, 2001), que amplifican la región intergénica que comprenden la parte final del gene que codifica para el 16S rRNA y la parte inicial del 23S rRNA. Con los cuales se obtuvo una banda de peso molecular entre 500-600 pb (Fig. 12).
Los resultados muestran que el tamaño varía un poco entre el producto obtenido a partir del DNA de cultivo puro y el de tejido, lo cual puede deberse a la
presencia de dos especies diferentes o a que en tejido existen más especies de cianobacterias, dando como resultado dos productos diferentes. Además se amplificó ADN de E. coli que fue utilizado como control positivo de la reacción, obteniéndose un producto del peso esperado y dos productos de menos de 400 pb (Fig. 12). Aun y cuando estos oligonucleótidos fueron diseñados específicamente para la región ITS de cianobacterias, se observó que amplifican con DNA de E. coli. La variaciónen tamaño puede deberse a las diferencias entre eubacterias y cianobacterias.
Figura 12. Análisis electroforético de productos de PCR de la región intergénica 16S-23S de cianobacterias, Carril: 1) Marcador de peso molecular, 2) Cianobacteria de cultivo puro, 3) Cianobacteria obtenidas de hepatopáncreas del estanque 6, 4)
E.coli. y 5) Control (-).
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500 2,000 300 150 1,500 1,000 750Los productos fueron digeridos con la enzima de restricción HhaI, la cual reconoce 4 nucleótidos. En la figura 13 se muestra un gel con los patrones de restricción obtenidos de los productos de PCR de la región ITS (16S-23S). En el carril 1 se muestra el RFLP del producto de PCR de la cianobacteria asilada, con la cual se obtuvieron 3 fragmentos de aproximadamente: 300, 200 y 100 pb, dando una suma de 600 pb, que corresponde al tamaño del producto amplificado sin digerir. El carril 2 muestra el RFLP del producto de PCR de las cianobacterias aisladas del hepatopáncreas, en este caso se obtuvieron 4 fragmentos de aproximadamente 300,200, 150 y 50 pb, dando una sumatoria de 710, la cual no corresponde con el fragmento sin digerir (600 pb). Pudiendo tratarse de una nueva especie no identificada, ó de la mezcla de DNA de otras cianobacterias o bacterias contaminantes que están alterando el patrón.
El patrón de restricción obtenido de la cianobacteria aislada, mostró similitud con el patrón de restricción de la cianobacteria Phormidium okeni II reportada por Lagunas (2003). Sin embargo, las características morfológicas no coinciden con este género. Además de presentar patrones de restricción diferentes entre cianobacterias de cultivo y de tejido. Lo cual puede deberse a la existencia de otras especies de cianobacterias en tejido como se mencionó anteriormente. La otra razón es que se haya amplificado DNA de bacterias contaminantes, ya que no es un cultivo axénico.
Por otro lado, obtenida la secuencia del gene 16S rRNA, se realizó un alineamiento con secuencias de este gene para observar el grado de similitud o divergencia, las cuales se editaron en el programa DNAstar, utilizando el programa MegAlign. La cianobacteria aislada, presentó un porcentaje de homología del 99 % con la cianobacteria Oscillatoria limnetica.
La discrepancia entre la identificación morfológica y molecular, puede deberse a que una región muy conservada del gene 16S rDNA se haya secuenciado, e impida observar variabilidad intra-especifica.
Figura 13. Análisis de restricción de la región intergénica 16S-23S de cianobacterias, con
la enzima HhaI. Foto I, carril: 1) Marcador de peso molecular, 2) RFLP de
cianobacterias de cultivo puro, 3) RFLP de cianobacterias obtenidas de hepatopáncreas. Esquema II, carril: 4) Marcador de peso molecular, 5) RFLP de cianobacterias de cultivo puro, 6) RFLP de cianobacterias obtenidas de hepatopáncreas 150 2,000 1,500 500 300 50
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DISCUSIÓN
Se probaron diferentes sondas, marcadas con tres diferentes fluorocromos: rojo, verde, amarillo. Teniendo mejores resultados con las sondas marcadas con color rojo. Esto puede deberse a la estabilidad del fluorocromo añadido o a que estos grupos no se encontraban metabolicamente activos en las muestras analizadas.
Para conocer la dominancia numérica de las especies o grupos activos metabólicamente, los métodos mas utilizados son la filtración o citometria para realizar conteos por células (Glöckner. et al. 1999; Snaidr. et al 1997; Amann et al, 1990). En este trabajo la particularidad de las muestras no permitió realizar el conteo bacteriano exacto de esta forma, ya que él numero de bacterias observadas y su distribución: (agrupadas o libres y en su mayoría intracelulares o unidas al tejido), impidió realizar ese tipo de conteo. Lo que dio como consecuencia la implementación de un método semi-cuantitativo para enumerar a las bacterias, el cual arrojó resultados que permitieron observar diferencias significativas en la presencia de los grupos. La enumeración bacteriana es ampliamente utilizada en estudios de diversidad bacteriana en diferentes tipos de muestras ambientales, agua de mar, lodos activados y biopelículas (Amann et al, 1995).
Una forma precisa para realizar conteos bacterianos en tejidos cuando existe gran cantidad de bacterias sería realizar microscopía electrónica de barrido
con cortes histológicos y PCR tiempo real (Olmos, 2003). Como en el trabajo realizado por Webster y colaboradores (2001) con la esponja Rhopaloeides adoribile, donde realizaron FISH de cortes de 10 µm de longitud, para localizar la distribución de las bacterias en la estructura de la esponja. Identificando una gran diversidad de grupos: Actinobacterias, bacterias gram positivas Bajas en G+C, β y γ subdivisiones de las Proteobacterias, Cytophaga/Flavobacterium, bacterias
verdes sulfurosas, bacterias verdes no sulfurosas, Planctomycetes, encontrándose en su mayoría en relación simbiótica.
Una de las limitaciones reportadas para la técnica de FISH es la autofluorescencia de algunos microorganismos como levaduras, Pseudomonas,
Legionella, Rhodospirillum centenum y cianobacterias, así como restos de material orgánico e inorgánico con fluorescencia natural (Moter et al, 2000). En el presente trabajo no se encontró señal de autofluorescencia con los controles realizados, por lo que podemos decir que se eliminó la posibilidad de obtener resultados falsos-positivos. (Poner un trabajo de autofluorescencia)
En los resultados obtenidos por FISH, se observó la presencia de cianobacterias en el hepatopáncreas del estanque 6 en el primer y segundo muestreo, con la nula o escasa presencia de bacterias creciendo a su alrededor, (Fig. 5A y 5B). Relación no observada en los estanques 9 y 10 en el primer muestreo, donde se observó gran cantidad de bacterias y cianobacterias coexistiendo (Fig. 5C). Es muy probable que se trate de otra especie de cianobacterias, debido a que no presenta la misma actividad o se encuentra en
otra etapa de crecimiento, además de encontrarse en otro tejido. Lo cual puede deberse a dos fenómenos principalmente: 1) hepatopáncreas es un órgano interno, que además, produce una gran cantidad de enzimas; estas características lo hacen ser de difícil acceso para los microorganismos. 2) la eliminación de bacterias por liberación de antimicrobianos, en caso que la cianobacteria se encuentre al inicio de la fase estacionaria, que es donde se realiza la producción de metabolitos secundarios (enzimas toxinas, antibióticos) (Bassler et al, 1997; Arce,. 2002), pudiendo ser normal el no encontrar la presencia de bacterias en ese tejido.
En general se observó en el primer muestreo que hepatopáncreas es el tejido menos colonizado seguido de intestino y branquia. Relación que cambio para el segundo y tercer muestreo, donde intestino y hepatopáncreas fueron los más colonizados y branquia el menor. Una explicación a esto puede ser, que la vía de entrada de los microorganismos a los tejidos empieza a través de la branquia en forma no invasiva, sino por contacto con el agua y alimento, explicación por la cual branquia es mayormente colonizada al inicio del cultivo, pasando a intestino y finalmente a órganos internos como hepatopáncreas.
En el segundo muestreo se observó un aumento en el número de grupos presentes, así como en el porcentaje de señal, esto debido quizás a los cambios en los parámetros y calidad del agua ( ). La variable que cambió drásticamente fue la temperatura de 25ºC a 32ºC, lo cual posiblemente ocasionó un aumentó en los grupos.
El siguiente mes la temperatura aumentó a 35ºC, con una diferencia de 3ºC entre el segundo y tercer muestreo, y de 10ºC desde el inicio del cultivo. Además, se presentó un cambio en la calidad de agua lo que originó un recambio del 100%. A pesar que la temperatura seguía aumentando, el número de bacterias disminuyó (Grafica 3), debido quizás a la calidad de agua que se vio favorecida por el recambio.
Una buena calidad de agua es necesaria para evitar el crecimiento bacteriano y la intoxicación debido a un aumento en la materia orgánica disuelta (amonio, sulfato, azufre, nitrógeno), lo que llevaría al animal a estar en estado de estrés y lo haría más susceptible a contraer una infección o enfermedad.
En este estudio se observaron principalmente los grupos Altas en G+C y
Proteobacterias γ. Sin embargo, en el tercer muestreo se vio que además de estos grupos se encontraban las Proteobacterias ά y δ. En el grupo de las
Proteobacterias δ se encuentran las especies Desulfovibrios, bacterias que se encargan de llevar a cabo los procesos de desulfuración, proceso que debe estar aumentando conforme madura el cultivo, dado que en el cultivo se encuentra una concentración elevada de materia orgánica disuelta.
En el análisis bacteriano por PCR se observó que los grupos identificados por FISH también se detectaron por PCR (Fig. 10). Además se detectaron otros grupos no identificados por FISH (Proteobacteriasβ, Pseudomonas y especies del genero Bacillus). Lo que corrobora que no sólo los grupos activos metabólicamente son los que están presentes en un cultivo.
La amplificación por PCR del 16S rDNA combinada con clonación y secuenciación, es una de las metodologías ampliamente utilizadas para identificar bacterias en muestras ambientales. Otras de las secuencias utilizadas para la detección de bacterias son las secuencias ctx que son factores de virulencia producidos por bacterias patógenas del genero Vibrio, tales como V. cholerae 01. Utilizando esta herramienta para identificar Vibrio cholerae en alimentos (Koch et al, 1993, Karunasagar et al, 1995).
Sin embargo, aunque el PCR ofrece una estrategia rápida para obtener información acerca de la composición de la comunidad microbiana, no aporta datos de la estructura y distribución de las bacterias en el ambiente, desconociéndose también su estado metabólico. Por lo que la combinación con la técnica de FISH amplían grandemente el conocimiento de la composición y estado metabólico de las bacterias (Hernández, 2000; Olmos, 2003).
De los grupos identificados por FISH y PCR en el presente trabajo, los más reportados en organismos marinos sanos o enfermos son los que pertenecen al grupo de las Proteobacterias γ, donde se encuentran clasificadas las familias
Enterobacteriaceae y Vibrionaceae. Algunas de las especies patógenas en microorganismos marinos cultivados son: Salmonella, Shigella y algunas especies del género Vibrio, también encontrados en agua y sedimento (Inglis et al, 2001)
En camarón se han identificado algunos patógenos utilizando herramientas moleculares (Nunan et al., 2002), para lo cual se diseñaron primers para la región 16S rRNA, utilizando estos fragmentos como sondas para hibridizaciones in situ
(ISH), marcadas con dioxigenina. Esta metodología fue en su inicio utilizada por Loy y colaboradores (1996), para identificar el agente etiológico de la enfermedad hepatopancreatitis necronizante en Penaeus vannamei cultivado. Sólo que aquí se utilizó la hibridación in situ con oligos fluorescentes, para detectar las bacterias en camarones infectados por Rickettsias, previamente identificadas por PCR, clonación y secuenciación.
Sin embargo, son pocos los estudios que se dirigen a identificar la diversidad bacteriana y sus cambios con el ambiente en camarón, utilizando ambas herramientas (FISH/PCR). Existe un trabajo previo en ostión (Hernández 2000), donde reportan bacterias gram positivas Bajas en G+C y Proteobacterias γ
en branquia de ostión, como grupos dominantes (metabólicamente activos) por FISH. En este trabajo también se reportaron los grupos metabólicamente inactivos como las bacterias gram positivas Altas en G+C, Proteobacterias β y ά, especies de Pseudomonas que fluorescen y del género Bacillus, por medio de PCR (Hernández, 2000).
Un producto de 500-600 pb fue obtenido de cianobacterias a partir de cultivo puro y de tejido, un ligero aumento en el tamaño fue observado en el producto obtenido de tejido, lo cual puede deberse a que se trata de dos especies diferentes o a que en tejido existen más especies de cianobacterias. Aun y cuando estos oligonucleótidos fueron diseñados específicamente para la región ITS de cianobacterias, se observó que amplifican un producto de menor peso con DNA
de E. coli. La variación en tamaño puede deberse a las diferencias entre eubacterias y cianobacterias.
El patrón de restricción de los ITS obtenidos en este trabajo, mostró similitud con Phormidium okeni II (Lagunas, 2003). Sin embargo, las características morfológicas no coinciden con este género. Además, de presentar patrones de restricción diferentes entre cianobacterias de cultivo y de tejido. Lo cual puede deberse a la existencia de otras especies de cianobacterias en tejido. La otra razón es que se haya amplificado DNA de bacterias, ya que no es un cultivo axénico.
El análisis de las secuencias del gene 16S rDNA muestra una homología del 99 % con Oscillatoria limnetica, aunque sus características morfológicas no coinciden con los reportados para esta especie. La diferencia en la morfología de la cianobacteria aislada y la reportada para ese género puede deberse, al tipo de medio de cultivo que se utilice, ya que esta reportado que esto influencia en su tipo de crecimiento y morfología. Las cianobacterias marinas, principalmente requieren de vitamina B12 para su crecimiento (Rippka, 1988), siendo el medio
mas utilizado para su cultivo el ASN III, que contiene 2.1 gr/lt de vitamina B12
(Rippka, 1988). En este trabajo se utilizó medio f1/2 con una concentración a la mitad de vitamina B12 (1 gr/lt), pudiendo deberse a esta deficiencia en vitamina B
que la cianobacteria aislada presentara un crecimiento diferente a la de esta especie.
La discrepancia entre la identificación morfológica y molecular, puede deberse también a que una región muy conservada del gene 16S rDNA se haya secuenciado, e impida observar variabilidad intra-especifica.
CONCLUSIONES
Se demostró que en Litopenaeus vannamei una gran diversidad bacteriana se encuentra presente coexistiendo y cambiando su estado de crecimiento, según sean favorables o no las condiciones ambientales. Lo que había sido subestimado por los métodos de identificación tradicionales.
Se encontró que la diversidad bacteriana presente en los tejidos de camarón L. vannamei, estuvo dominada en los tres muestreos por dos grupos principales: altas en G+C y Proteobacterias γ, seguido por el grupo de las
Proteobacterias δ.
El tejido que presentó un mayor dinamismo en la composición de su microbiota fue el Intestino, seguido de Branquias y finalmente el menos colonizado fue Hepatopáncreas.
Los estanques que tuvieron mayor presencia de grupos bacterianos fueron los estanques 8, 9 y 10.
También se demostró que el aumento en la temperatura y la calidad del agua son factores importantes, que interfiere de gran manera en el desarrollo
bacteriano. Por lo que se concluye que en el segundo muestreo es cuando hay una mayor presencia de bacterias.
También se demostró la aplicabilidad de la técnica de FISH para identificar bacterias metabólicamente activas, cultivables y no cultivables, así como la aplicación de PCR para identificar diversidad bacteriana total, en cultivos semi- intensivos de camarón Litopenaeus vannamei.
En general podemos decir que las técnicas de FISH y PCR son herramientas moleculares con gran aplicabilidad en el conocimiento de la diversidad microbiana en cultivo de camarón siendo estas confiables, rápidas y precisas para ser utilizadas como métodos de diagnostico en la camaronicultura.
PERSPECTIVAS
Siendo un trabajo que aporta información muy amplia y general, en cuanto a la composición de la microbiota presente en ecosistemas abiertos, las perspectivas son diversas. Lo primero que se propone es la identificación a nivel de especies de los grupos más importantes que se identificaron y que tengan antecedentes como patógenos o probióticos.
Para lo que se propone la construcción de bibliotecas genómicas y el diseño de sondas especificas, con lo que se podría obtener información mas precisa de la diversidad bacteriana presente en muestras de camarón.
También se pueden realizar estudios para conocer cómo cambia la diversidad bacteriana, al ser influenciada por las condiciones del medio en condiciones de laboratorio. Todos estos conocimientos permitirán la caracterización de la población bacteriana in situ en los cultivos de camarón, tanto a nivel de composición poblacional como al de los cambios bioquímicos. Lo que llevara a tener un mejor monitoreo y control del desarrollo y la actividad de la poblaciones microbianas que se desarrollen en el estanque de cultivo.
En cuanto a la actividad de la cianobacteria, se propone realizar un escalamiento del cultivo y seguir la curva de crecimiento, para encontrar donde se
liberan los metabolitos secundarios y así mismo buscar el tipo de bioactividad que puedan mostrar.
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