Alteración estructural de la placa mediante raspados

Las placas de cromatina son estructuras estables, como lo demuestran los expe- rimentos visualizados mediante TEM, AM-AFM mode, e incluso mediante contact mode (en solución). En un intento de caracterizar mejor las propiedades estructura-

les y la cohesión de las placas de cromatina, se realizaron raspados sobre diferentes puntos de la placa2_{. En las Figuras 16.11 y 16.12 (pág. 172) se pueden observar} ejemplos de este procedimiento experimental.

El comportamiento de la placa variaba en función de la zona de raspado. Cuando el raspado se realizaba en una zona interna (Figura 16.11C→E y 16.12C→D) la

estructura de la placa permanecía esencialmente inalterada; sólo en algún caso se podía observar la reorganización y/o desaparición de algún agujero interno. Sin embargo, cuando la zona de raspado incluía los bordes de la placa, el comportamiento era totalmente diferente. En estos casos la placa se rompía exactamente por la zona en la que se realizaba el raspado (ver ejemplo en Figura 16.11A→C; y resultados

más claros en la Figura 16.12A→CyD→E).

Estos resultados sugieren que el filamento de cromatina forma un tejido que está fuertemente cohesionado en las regiones internas de la placa, pero que es más fácilmente desestructurable en las zonas periféricas.

2_{El raspado consistía en realizar una imagen en}

contact mode, aplicando mucha fuerza, en una zona concreta de la placa.

Figura 16.11 (en la página siguiente): Placas a las que se les ha realizado un raspado (serie 1). Los cromosomas se purificaron mediante gradiente de sacarosa (sección 9.4.1), se diali-

zaron en solución durante 4 h (sección 9.5.2), se trataron mecánicamente con jeringuilla (sección 9.6) y finalmente se extendieron sobre mica por adsorción en PME (sección 11.8.2). (A, C y E)

Imágenes topográficas; (B,D y F) Imágenes de amplitud. En C se observa la placa después de

realizar un raspado en la zona delimitada por el cuadro indicado enA. (E) Placa después de realizar

un raspado en la zona delimitada por el cuadro indicado enC. Barras:C yD500 nm;A,B,Ey F200 nm;

16.7 Alteración estructural de la placa mediante raspados 171

C

D

E

F

e f

A

B

D

E

F

C

E

F

Figura 16.12: Placas a las que se les ha realizado un raspado (serie 2). Los cromosomas

se purificaron mediante gradiente de sacarosa (sección 9.4.1), se dializaron en solución durante 4 h (sección 9.5.2), se trataron mecánicamente con jeringuilla (sección 9.6) y finalmente se extendieron sobre mica por adsorción en PME (sección 11.8.2). (A,C–E) Imágenes topográficas. (B) Imagen

de amplitud. (C) Placa después de realizar un raspado en la zona delimitada por el cuadro indicado

enA. (D) Placa después de realizar un raspado en la zona delimitada por el cuadro indicado enC.

(E) Placa después de realizar un raspado en la zona delimitada por el cuadro indicado enD. (F)

Representación de los perfiles de altura correspondientes a las secciones delimitadas por las líneas enA,CyE. Barras:A–E 200 nm.

Capítulo 17

AFS: Nanoindentación de la

placa de cromatina

La placa de cromatina tiene una consistencia mecánica que se ha ido constatando a lo largo de los diferentes experimentos realizados en esta tesis y en particular en la alteración estructural producida por los raspados (ver sección 16.7). Mediante los es- tudios de nanoindentación se puede realizar un análisis más detallado y cuantitativo del comportamiento mecánico (Ebner et al., 2007) de las placas de cromatina, que nos permitió evaluar la resistencia mecánica y el módulo de Young de la estructura.

17.1.

Propiedades mecánicas de la placa de cromatina

Para obtener información de las propiedades mecánicas de las placas se reali- zaron curvas de fuerza o experimentos de nanoindentación (ver sección 14.3.1). En un experimento de fuerzas la punta se va aproximando a la placa hasta contactar con ella, momento en el cual hay una compresión/deformación (ver introducción, sección 6.3.1). En la Figura 17.1 podemos observar dos ejemplos de curvas de fuerza corregidas (Fv vs.δ; ver sección 14.3.2). En presencia de Mg2+ 5 mM, la curva nos

muestra que a parte de una deformación progresiva de la placa hay una transición (o deformación plástica) a 2 nN (c, salto de 0.9 nm), seguido de una transición ma-

yor (d, salto de 2.9 nm) a 4.4 nN que consigue penetrar totalmente la placa hasta

llegar al soporte de mica. Las curvas de fuerza de las placas en presencia de Mg2+ 20 mM tienen una forma similar pero, en este caso, muestran una única transición (c0, salto de 2.5 nm) a una fuerza más elevada (6.2 nN). El estrés requerido para

provocar las deformaciones plásticas principales en Mg2+ _{5 y 20 mM es 24 y 37} MPa, respectivamente (ver sección 14.3.4). Cuando la punta está muy cerca de la muestra se establecen fuerzas repulsivas o atractivas que provocan una deflexión del

cantilever como se observa (regiones b y b0) en la primera parte de las curvas de

Mg2+ _{5 mM, después de la fase de aproximación de la punta (región a) podemos} observar un incremento en la fuerza de forma exponencial. Este comportamiento es debido a una repulsión punta-muestra. En las condiciones de trabajo (pH 7.2) la punta de Si3N4 tiene una densidad de carga negativa (σ−; Butt, 1991; Oncins et al., 2005), en consecuencia, este resultado indica que las placas de cromatina tienen una superficie con una σ−. En cambio, las curvas realizadas en presencia de Mg2+ 20 mM presentan un comportamiento diferente; se observa que la punta no se defle- xiona tan claramente debido a la repulsión, lo cual indica que hay una reducción de la repulsión electrostática (región b0) entre la punta y la muestra. Este cambio

en σ de las placas pude ser debido a que el DNA contenido en su interior esté más apantallado debido a que hay una mayor concentración de Mg2+_.

10 nm a b c d a´ b´ c´ Mg 5 mM2+ Mg 20 mM2+ d´ e

Figura 17.1: Curvas deFvvs.δ.Los experimentos de nanoindentación se realiza-

ron en medio acuoso en presencia de PME conteniendo las concentraciones de Mg2+

indicadas. En Mg2+ _{5 mM, la primera transición (}

c) corresponde a la penetración

de 0.9±0.4 nm que se obtuvo a 2.0±0.6 nN (n=30); en la transición principal (d)

la penetración es de 2.9±0.6 nm y ocurre a 4.4±0.4 nN (n=30). En Mg2+ _{20 mM}

sólo hay una transición (c0) correspondiente a una penetración de 2.5±0.3 nm que ocurre a 6.2±0.7 nN (n=32). La deflexión del cantilever es zero en las regiones a

ya0; las regiones byb0 corresponden a una deflexión delcantilever producida por fuerzas repulsivas entre la punta y la muestra; en las regiones ey d0 la punta está

en contacto con la superficie de mica y la deflexión es muy elevada. Adicionalmente se realizó una aproximación, con el programa SPIP™, de las fuerzas a las que se establecían las transiciones en presencia de Mg2+ _{15 mM: 6.8±1.7 nN (n=78); 25}