10 AMPLIFICACIÓN DE DNA POR PCR CUANTITATIVA (REAL TIME)

La PCR a tiempo real permite monitorizar el progreso de la PCR en cada momento, por lo tanto, permite detectar cuando empieza la amplificación de cada muestra. El ciclo en el que se empieza a detectar el aumento de fluorescencia se denomina ciclo umbral (Ct, de threshold cycle) y es inversamente proporcional a la concentración inicial de DNA diana presente en

la muestra. Este seguimiento se hace gracias a una sonda de DNA complementaria a una región del cDNA.

La sonda es un oligonucleótido que tiene un fluorocromo donador en el extremo 5' y tiene un fluorocromo aceptor en el extremo 3'. Cuando la sonda está intacta, la proximidad del fluorocromo aceptor reduce considerablemente la fluorescencia emitida por el fluorocromo donador por un proceso de transferencia de energía fluorescente mediante resonancia (FRET). La sonda hibrida con una región downstream del cebador y es cortada por la actividad nucleasa 5' de la Taq DNA polimerasa en el proceso de extensión del cebador. Este corte provoca la fragmentación del oligonucleótido y como consecuencia la separación del fluorocromo aceptor y el donador, permitiendo así la emisión de fluorescencia. La intensidad de fluorescencia emitida se puede correlacionar con la cantidad del producto que se amplifica. El gen que comience con mayor número de copias emitirá más fluorescencia.

Para la determinación cuantitativa del mRNA de TNFα y de sus dos receptores se preparó una mezcla para la reacción de amplificación que constaba de: los cebadores (10 µM); sonda fluorogénica (20 µM, fluorocromo FAM) para el TNFα y sus receptores que formaban parte de un kit (Applied Biosystems) y de Taqman Universal Master Mix (2X; que contenía la DNA polimerasa AmpliTaq Gold, la AmpErase UNG para prevenir la contaminación con dUTP, los desoxirribonucleótidos trifosfato (dNTPs), Rox como fluorocromo de referencia pasiva y además los componentes del tampón). Se dispensaron 20 μL de la mezcla en una placa óptica de 96 pocillos y se añadieron 5 μL del producto de la retrotranscripción, cDNA, equivalente a 100 ng. La placa se selló con un plástico adherente para evitar la evaporación durante la reacción de PCR y se centrifugó un pulso para reunir los 25 μL de volumen final. La reacción de amplificación se llevó a cabo en el equipo de PCR a tiempo real ABI 7000 Sequence Detectión System (Applied Biosystems) y constó de 2 etapas. La primera con un ciclo inicial de 2 minutos a 50º C, para activar la AmpErase UNG, seguido de otro ciclo de 10 minutos a 55º C, para activar la DNA polimerasa. La segunda etapa consistió en 40 ciclos en los que primero se desnaturalizaba el DNA con 15 segundos a 95º C y después un minuto a 60º C

para la rehibridación y extensión de la cadena. Como control endógeno de expresión se utilizó el gen del enzima Gliceraldehido-3-fosfato Deshidrogenasa (GAPDH) que se expresa constitutivamente. Para ello se utilizó el reactivo de Applied Biosystems, Rodent GAPDH control reagents, que constaba de los cebadores (300nM) y la sonda (200 nM, fluorocromo VIC).

La cuantificación del mRNA se hizo de forma relativa respecto al mRNA de GAPDH mediante el software ABI Prism SDS v1.1 Relative Quantification Study.

11.- MICROARRAY

11.1.- Fundamentos moleculares del microarray

La estrategia general del microarray consiste en poner una micromatriz (cristal, plástico o silicio) oligonucleótidos de DNA que contengan secuencias específicas de los distintos genes que se quieren estudiar. Estas secuencias sirven como sondas que hibridan con el cDNA o cRNA de la muestra (extraídas de las células sometidas a estudio, también denominadas diana) bajo condiciones altamente restrictivas. La hibridación sonda-diana suele detectarse y cuantificarse mediante fluorescencia ya que el cDNA o cRNA diana va marcando con un fluoróforo, de esta manera se puede determinar la relativa abundancia de las secuencias de ácidos nucleicos diana. Después se analiza la imagen obtenida para obtener un patrón de intensidades en cada casilla.

Actualmente coexisten diferentes plataformas para llevar a cabo el análisis comparado de la expresión génica utilizando microarrays (los mRNAs bajo estudio pueden marcarse de diferentes maneras, el DNA inmovilizado en el chip puede ser cDNA u oligonucleótidos de distinta longitud, la hibridación de las muestras en el chip puede ser simultánea o en chip independientes, etc.). Entre estas plataformas las que utilizan oligonucleótidos son los más utilizados dentro de la investigación científica y concretamente el GeneChip de Affymetrix es el más común.

Figura 15. Esquema general del array GeneChip de Affymetrix.

(Recurso: http://plasticdog.cheme.columbia.edu)

Estos chips de Affymetrix contienen todo el genoma de un organismo en forma de oligonucleótidos específicos, cada uno de ellos tiene aproximadamente 25 pares de bases. El procedimiento básico utilizado es muy similar al array de cDNA anteriormente explicado. Brevemente, el mRNA se extrae de las células y se realiza la transcripción inversa para obtener el cDNA. Posteriormente se realiza una transcripción in vitro para obtener cRNA marcado con biotina. Estas moléculas de cRNA son expuestas al microarray toda una noche para que hibriden con las sondas. Después el chip se marca estreptavidina conjugada con una molécula fluorescente (ficoeritrina) que se une a la biotina. El protocolo incluye además otro paso para amplificación de la señal mediante un anticuerpo anti-estreptavidina y un anticuerpo IgG biotinilado. Un escáner se encarga de analizar las señales del chip y posteriormente se utilizan avanzados

algoritmos para obtener los datos de los niveles de expresión de los genes de interés (ver figura 15).

11.2.- Muestras y plataforma utilizada para el análisis

Para el estudio de expresión génica se utilizó el GeneChip® Rat Genome 230 2.0 Array (Affymetrix Inc.) que nos permitía cubrir el genoma de rata en un solo array, ya que se utilizan más de 31.000 sondas, analizando unos 30.000 transcritos y variantes de unos 28.000 genes bien conocidos de rata.

Se eligieron dos tiempos 0h y 6h en los que se extrajo el RNA de los cultivos sometidos a OGD y también a los cultivos control (normoxia). Para el estudio se utilizaron dos experimentos independientes. En todos los casos, los datos de la OGD se compararon con el control recogido al mismo tiempo. Las muestras de RNA se enviaron al servicio de microarray del hospital Vall d’Hebron, donde se realizó una comprobación de la integridad del RNA mediante 2100 Bioanalyzer (Aligent) y posteriormente realizaron el estudio de expresión génica utilizando el chip de Affymetrix. Una vez realizado el estudio, el servicio nos envió los datos brutos de expresión obtenidos en el chip.

11.3.- Análisis de los datos obtenidos del microarray

Los datos de expresión del chip de Affymetrix en primer lugar se utilizó el programa estadístico RMA (Robust multiarray average) que permite normalizar los datos teniendo en cuenta el background (Irizarry et al. 2003). Después se utilizó el paquete informático LIMMA para realizar el estudio estadístico y así identificar los genes up-regulados o down-regulados integrando los duplicados utilizando un valor de p < 0.05. Para los genes con varias sondas se eligió la más informativa, teniendo en cuenta el valor de p más pequeño.

Para el análisis posterior de los datos se utilizó el programa estadístico DAVID 2.0 (DAVID Bioinformatics Resources 2008, NIAID/NIH) que está disponible on- line (http://david.abcc.ncifcrf.gov/summary.jsp). Este programa ofrece potentes herramientas bioinformáticas, permitiéndonos realizar un análisis ontológico y

además presentar los grupos funcionales de genes en clusters. Para realizar estos análisis sólo se introdujeron los genes que tenían un incremento de al menos dos veces su expresión inicial (FC > 2-folds). Los resultados obtenidos del análisis se priorizaron según el score EASE (Expression Analysis Systematic Explorer). EASE es un software que permite hacer una rápida interpretación biológica de una lista de genes resultantes de un microarray, entre otros. Básicamente, el EASE score es una modificación del valor-P de Fisher para el análisis del incremento de genes. Normalmente a partir de un valor de p ≤ 0.05 se considera que existe un fuerte incremento de la expresión génica (Hosack et al. 2003).