Amplificación de DNA por reacción en cadena de la polimerasa Taq

Las amplificaciones se llevaron a cabo en un termociclador RoboCycler Gradient 96 (Stratagene), según se especifica en cada caso utilizando el enzima DNA polimerasa Taq de Thermus aquaticus YT1 (Saiki y col., 1985).

II.2.3.1. Vector pGEX-VPg.

Para construir el vector de expresión pGEX-VPg, la región codificadora de la proteína fue amplificada usando como cebadores para la iniciación de la síntesis los oligonucleótidos 3B5a (Tabla 1), que incluye en su extremo 5’ una secuencia de reconocimiento para el enzima de restricción BamHI y 3B3 (Tabla 1) que incluye la secuencia de reconocimiento para EcoRI, e hibridan respectivamente en las posiciones 2989-3014 y 3310-3333 de la secuencia del cDNA del aislado AST/89 del RHDV.

En la reacción de amplificación se mezclaron aproximadamente 30 ng de un fragmento de cDNA del genoma del virus, que contiene la secuencia de la VPg, con los dos oligonucleótidos (10 pmoles de cada uno), los dNTPs a una concentración final de 200 µM en el tampón de reacción y 1 U de DNA polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó 5 min a 94ºC y a continuación 5 min a 72ºC momento en el que se añadió la DNA

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polimerasa (hot start). A continuación se realizaron 5 ciclos de amplificación que constan de los siguientes pasos: desnaturalización 30 s a 94ºC, unión de los cebadores 30 s a 50ºC y elongación 30 s a 72ºC; y posteriormente 30 ciclos en los que se realizó la desnaturalización 30 s a 94ºC, la unión 30 s a 60ºC y la elongación 30 s a 72ºC. Finalizados los 30 ciclos, se incubó 5 minutos a 72ºC para finalizar la síntesis de todas las cadenas ya comenzadas.

Tabla 1: Oligonucleótidos usados para la amplificación y clonación de los cDNAs de las proteínas VPg y 3CD del RHDV, mutagénesis dirigida y secuenciación.

Nombre Secuencia (5’ – 3’) Posicióna Polaridad

3B5a GGatccAAAGGCAAGACGAAACGTGG 1989 + 3B3 GAATTCACTCATAGTCATTGTCATAAAAGCC 3333 – ∆5VPg22 GGATCCGACGAATGGCAAGCTGCACGCAG 3052 + ∆ 3VPg91 GAATTCAGCGGATGACCTCGTTTCTCAC 3261 – 3VPgYF CAGCTTGCCATTCGTCAaACTCGTCATTGCCCAAG 3067 – 3VPgYT CAGCTTGCCATTCGTCAgtCTCGTCATTGCCCAAG 3067 – 3VPgYS CAGCTTGCCATTCGTCAgACTCGTCATTGCCCAAG 3067 – 3C5’B GGATCCCCTGGGTTCATGAGACAC 3340 + 3CD3’ GGATCCTCACTCCATAACATTCACAAACTC 5310 – 3CDC121G CCCACGGTGACgGTGGGCTGCCG 3632 + 3CDE1250G AAGGGAGTTTATGgAACATCAAACTTCTTC 3748 + BX GGGATCCACTAGaTCTAGtGCGGCCGCCACC --- SP6 TATTTAGGTGACACTATAG --- T7 TAATACGACTCACTATAGGG --- 5’GST AGATCTATGTCCCCTATACTAGGTTATTGG --- 3’GST AGATCTGGCAGATCGTCAGTCAGTCACG --- GEX 5 GGGCTGGCAAGCCACGTTTGGTG --- GEX 3 GTGACCGTCTCCGGGAGC ---

Los residuos subrayados indican las dianas de restricción. En minúscula se indican las mutaciones puntuales. a Posición del primer nucleótido del extremo 5’ de la secuencia del RHDV positiva o negativo

II.2.3.2. Vector pGEX-3CD.

Para construir el vector de expresión pGEX-3CD, la región codificadora de la proteína 3CD fue amplificada usando como cebadores para la iniciación de la síntesis los oligonucleótidos 3C5’B y 3CD3’ (Tabla 1), que hibridan respectivamente en las posiciones 3334-3357 y 5290-5310 de la secuencia del cDNA del aislado AST/89 del RHDV. Ambos cebadores incluyen en sus extremos 5’ una secuencia de reconocimiento para el enzima de restricción BamHI.

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En la reacción de amplificación se mezclaron aproximadamente 30 ng del plásmido pRC30 (apartado II.1.4) (Martín Alonso y col 1996), con los dos oligonucleótidos (10 pmoles de cada uno), los dNTPs a una concentración final de 200

µM en el tampón de reacción y 1 U de DNA polimerasa Taq. Esta mezcla se incubó 5 min a 94ºC y a continuación 5 min a 72ºC. A continuación se realizaron 5 ciclos de amplificación que constan de los siguientes pasos: desnaturalización 30 s a 94ºC, hibridación de los oligonucleótidos 1 min a 44ºC y elongación 2 min a 72ºC; y posteriormente 25 ciclos en los que se realizó la desnaturalización 30 s a 94ºC, la unión 1 min a 56ºC y la elongación 2 min a 72ºC. Finalizados los 30 ciclos, se incubó 5 minutos a 72ºC para finalizar la síntesis de todas las cadenas ya comenzadas.

II.2.3.3 Amplificación de fragmentos del RHDV.

Para generar amplicones conteniendo el genoma completo o el mensajero subgenómico del RHDV bajo el promotor de T7 se diseñaron los oligonucleótidos sintéticos indicados en la tabla 2. El RHDV1 contiene un poli(T) seguido de la secuencia complementaria de los 20 últimos nucleótidos. Los cebadores RHDV2, RHDV3 y RHDV4 presentan un sito de corte NotI seguido de la secuencia del promotor de la polimerasa del fago T7 (indicado en color rojo en la tabla) y de la secuencia de los 20 primeros nucleótidos del extremo 5’ del RNA viral.

La reacción de PCR se realizó en un volumen de 25 µl de mezcla de reacción que contenía los dos oligonucleótidos (10 pmoles de cada uno), dNTPs a una concentración final de 200 µM en el tampón de reacción, 1 U de DNA polimerasa Taq y aproximadamente 30 ng del plásmido pRC43 digerido con EcoRV. Las condiciones de desnaturalización, hibridación y amplificación para cada uno de los amplicones se indican en la tabla 3. El producto de PCR fue examinado por electroforesis en geles de agarosa del 0,7%.

Los oligonucleótidos RHDV2 y RHDV3 se modificaron de tal forma que en el extremo 5’ se incluyó la secuencia del promotor T7 (Tabla 2) seguido de la guanina correspondiente al primer nucleótido de la secuencia viral tanto del RNAg como del RNAsg. De esta forma los transcritos generados no incluyen teóricamente ninguna base

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de origen no viral en su extremo 5’. El oligonucleótido RHDV4 además de presentar en el extremo 5’ la secuencia del promotor T7 contiene, a continuación la secuencia GGGGCGGG para incrementar los niveles de síntesis del RNA de polaridad negativa.

Tabla 2: Oligonucleótidos usados para la amplificación del cDNA y posterior transcripción in vitro de los amplicones obtenidos.

Nombre Secuencia (5’ – 3’) Posicióna Polaridad

RHDV 1 (T)25ATAGCTTACTTTAAACTATAAAC 7437 –

RHDV 2 ccGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTGAAAATTATGGCGGCTATG 1 +

RHDV 3 ccGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTGAATGTTATGGAGGGCAAA 5296 +

RHDV 4 accGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGGCGG(T)23ATAGCTTACTTTAAAC 7437 –

RHDV 5 GTGAAAATTATGGCGGCTATGTCGCG 1 +

RHDV 6 GTGAATGTTATGGAGGGCAAAGCCCG 5296 +

3 neg21 accGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGGTGCTCACTCTTGATAAGGTCC 2145 –

3neg64 accGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGGGAGATGGGATTGTCGATTGCAGAC 6292 –

82-106 ccGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGAGGGGTCTTATCCCTGAGGTCCAG 106 –

108-133 ccGCGGCCGCTAATACGACTCACTATAGTTTCCCGGTTGCCCGAATACAACAG 133 –

63-88 GAAACCCTTAAATTTCTTCCTGGACC 63 +

E54A ACGGAAAAGcAGGACCTCTGG 161 +

RHDV151plus GAAAGACTGGCCAAGCCAGTTTCC 151 –

RHDV151min ccgcggccgcTAATACGACTCACTATAGAAAGACTGGCCAAGCCAGTTTCC 151 –

RHDV100-3plus ccgcggccgcTAATACGACTCACTATAGAATAATAGTGTTAAGATTTATAAC 7330 +

GG GTTGGCACCCcCAAATGAGGC 2172 –

La secuencia en rojo es el promotor de T7. La secuencia GGGGCGG se insertó detrás del promotor de T7 para incrementar los niveles de síntesis del RNA de polaridad negativa. Los residuos subrayados indican las dianas de restricción. En minúscula se indican las mutaciones puntuales. a Posición del primer nucleótido del extremo 5’ de la secuencia del RHDV positiva o negativo

Igualmente utilizamos este método para obtener por PCR distintos fragmentos del genoma del RHDV. Para ello se diseñaron los oligonucleótidos descritos en la tabla 2. Con las parejas de oligonucleótidos adecuadas y las condiciones de reacción indicadas en la tabla 3 se obtuvieron productos de PCR a partir de los cuales se generaron RNAs sintéticos de polaridad positiva y negativa.