Análisis las comunidades microbianas en muestras de suelo y de rizosfera-rizoplana

Con el objetivo de estudiar la diversidad de las distintas comunidades microbianas en las muestras compuestas de suelo y de rizosfera-rizoplana, se utilizó la metodología de análisis automatizado de espaciador intergénico ribosómico (o ARISA, por sus siglas en inglés Automated Ribosomal Intergenic Spacer Analysis). ARISA es un método que estima las unidades taxonómicas operacionales en una muestra (OTUs), basado en la heterogeneidad de longitud de la región espaciadora intergénica (ISR) bacteriana presente entre gen del ARN ribosomal 16S y el gen del ARN ribosomal 23S.

El procedimiento para todas las muestras se llevó a cabo en cuatro etapas diferentes. La primera consistió en el aislamiento del ADN de la matriz de origen, la segunda en realizar una reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de la región espaciadora interna transcrita (ITS), la tercera en la

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separación de los fragmentos amplificados mediante electroforesis capilar, y la cuarta en el análisis e interpretación de los electroferogramas obtenidos mediante el uso de softwares específicos.

Las muestras compuestas de suelos de procesaron por “duplicado biológico”, lo que generó un total de 6 perfiles de ARISA por cada lote.

La PCR de la región ITS, que se encuentra entre el gen que codifica al ARNr 16s y el ARNr 23S se llevó a cabo usando el conjunto de primers forward: TGCGGCTGGATCCCCTCCTT - reverse: CCGGGTTTCCCCATTCGG (Sillen et al., 2015). Los productos de amplificación fueron chequeados mediante electroforesis en gel de agarosa 1%. Las condiciones de PCR fueron:

Los productos de amplificación fueron cargados en chips Agilent DNA 1000, para luego llevar a cabo electroforesis capilar automatizada basada en la detección de fragmentos de ADN mediante fluorescencia, usando el equipo 2100 Bioanalyzer® (Agilent Technologies, Diegem, Bélgica). Luego de cada corrida se obtuvieron a partir del software del equipo, los electroferogramas y perfiles densitométricos para cada muestra.

Los electroferogramas y perfiles densitométricos de cada muestra se exportaron y se procesaron utilizando el paquete StatFingerprints, en la versión de software R v2.13 (http://cran.at.r-project.org). Los análisis estadísticos y gráficos se llevaron a cabo utilizando el programa PAleontological Statistics (PAST) v3.14 (Hammer et al., 2001) y GraphPad v5.1.

Tabla 4.2. Volúmenes de reacción de la PCR Tabla 4.3. Ciclo de PCR. El recuadro azul indica el ciclo

de amplificación, que se repitió 25 veces.

Reactivo Volumen (uL) Temperatura (°C) Tiempo (minutos)

Buffer de reacción 10X 2,5 94,0 3,0 MgSO4 50 mM 1,0 94,0 1,0 dNTP mix 25 mM 0,5 55,0 0,5 Primer fwrd 10 uM 0,5 72,0 1,0 Primer rev 10 uM 0,5 72,0 5,0 Agua 19,4

Platinum Taq® High Fidelity 0,12

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4.3 Resultados y discusión

4.3.1 Caracterización fisicoquímica de los suelos

Se llevó a cabo la caracterización textural y fisicoquímica de los suelos correspondientes a los dos pares de lotes (L1+L2 y L3+L4), de orden Molisol, suborden Acuol, gran grupo Natracuol y subgrupo Típico, de acuerdo con la información suministrada por la chacra experimental Manantiales en base a los criterios de taxonomía de suelos del ministerio de agricultura de los Estados Unidos (USDA). Los resultados obtenidos se muestran en la tabla 4.4.

Los resultados muestran que ambos suelos poseen textura franca, con muy bajos valores de fósforo, característico de la región de la pampa deprimida, con muy alto contenido en sodio y una muy baja capacidad de intercambio catiónico. Presentan también una adecuada cantidad de materia orgánica y valores normales de relación C/N (estimados en base el contenido de MO). Los suelos L1 y L2 son ligeramente alcalinos mientras que los suelos L3 y L4 son neutros. Es posible que los aún más bajos valores de fósforo en los suelos L1 y L2 se correlacionen con la alta cantidad de iones Ca, y con el valor de pH alcalino, haciendo el fósforo menos biodisponible (favoreciendo la forma de Ca3(PO4)2).

Tabla 4.4. Caracterización fisicoquímica de suelos.

Arcilla Limo Arena P mg Kg-1 N % K mEq 100g-1 Ca mEq 100g-1 Na mEq 100g-1 Mg mEq 100g-1 pH Materia Orgánica (%) CIC (mEq 100g-1₎ Elemento 0,256 1,1 20 8,6 0,4 6,7 7,4 4,5 6,8 8,6 8,3 5,9 L1 y L2 L3 y L4 Suelos 23 46 31 Determinación Textura (%) 32 50 18 7,0 7,6 1,1 0,206 8,62 6,36

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El moderado contenido de arcillas y la presencia de metales divalentes en los suelos (ya sea Ca para suelo L1 y L2 o Ca + Mg para suelo L3 y L4) podrían jugar un papel relevante en la adsorción de glifosato, por mediarse interacciones entre el grupo fosfonato de la molécula y los iones divalentes, ya sea en forma libre como así también los que conforman los distintos minerales de la arcilla.

En contraposición a lo discutido en el párrafo anterior, el pH neutro a alcalino presente en estos suelos, junto con las altas concentraciones de materia húmica encontradas, podría causar una mayor tasa de lixiviación y escorrentía de la molécula.

En definitiva, el grado en el que el glifosato aplicado periódicamente quede adsorbido a un determinado suelo dependerá de la integración de todos los fenómenos complejos en los que cada componente toma parte. El fósforo como elemento externo (fertilizante) fue especialmente estudiado, y como también se discutió con anterioridad, existe evidencia que el grupo fosfonato del glifosato compite por los sitios de unión de los fosfatos solubles. En la situación que presentan estos suelos, podría verse muy favorecida la adsorción y por ende retención de glifosato debido a su bajo contenido de fósforo. Esta combinación de efectos es particularmente importante desde la perspectiva ambiental, porque ayuda a reducir la movilidad de una molécula que no presenta grandes niveles de residualidad en suelo, pero sí contamina los cursos de agua que reciben los escurrimientos de las zonas de cultivo.

Por otra parte, estos resultados validan el diseño de muestreo, ya que la decisión de buscar microorganismos tolerantes y degradadores en los lotes estudiados no se basó solamente en el tratamiento de promoción allí llevado a cabo, sino también en el hecho de que los contenidos de fósforo soluble en la región de la Pampa deprimida son muy bajos, pudiéndose favorecer la presencia de microorganismos capaces de metabolizar grupos fosfonatos.