Análisis cuantitativo de medidas lineales

postcraneales con calibre digital (precisión de 0,01 mm) (Tabla 2.2). Estas incluyeron a las longitudes totales de las principales regiones axiales, así como las longitudes máximas de los principales huesos largos y algunos elementos autopodiales. En el caso de las longitudes de regiones axiales se tomaron valores preferentemente de especímenes articulados. En el caso de especímenes de regiones axiales completas pero desarticuladas, se sumaron las longitudes de los cuerpos de los elementos vertebrales independientes, y estos valores sólo se utilizaron en los índices netamente axiales (en donde tanto en el denominador como numerador eran longitudes de regiones axiales), con el fin de evitar desvíos mayores relativos a la pérdida de discos intervertebrales (aproximadamente un octavo de la longitud de cada sector axial medido, Savage 1957). El largo del miembro anterior fue calculado a partir de la suma de los largos parciales del húmero, radio y metacarpal III, mientras que el largo del miembro posterior a partir de la suma del fémur, tibia y metatarsal III.

A partir de estas medidas (ver Tabla 2.2) se construyeron 8 índices: Largo tóraco- lumbar relativo a largo promedio de los miembros (LaTL/PrLaM), largo cervical relativo al largo tóraco-lumbar (LaCe/LaTL), largo lumbar relativo al largo tóraco-lumbar (LaLu/LaTL), largo sacro-caudal relativo al largo tóraco-lumbar (LaSC/LaTL), largo del miembro anterior relativo al largo del miembro posterior (LaMA/LaMP = índice intermembral), largo del radio relativo al largo del húmero (LaRa/LaHu = índice braquial), largo del metacarpal III relativo al largo de la falange proximal del dígito III (LaMcIII/LaFIII), largo de la tibia relativo al largo del fémur (LaTi/LaFe = índice crural). Estos índices, típicamente utilizados en otros estudios (e.g., Slijper 1946, Davis 1964, Holmes 1980, Van Valkenburgh 1987, Iwaniuk et al. 1999; ver también aclaraciones en epígrafe de Tabla 2.2), se encuentran principalmente diseñados para sintetizar las proporciones entre elementos, o sectores postcraneales, y son complementarios con los análisis de morfometría geométrica (que se focalizan en sectores más específicos, ver más adelante).

Los valores de estos índices fueron calculados a partir de las medidas tomadas para cada espécimen analizado (Apéndices 2.3, 2.4). Los valores promedios de cada especie fueron analizados en un contexto morfo-funcional y comparativo, incluyendo un gran número de

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especies de musteloideos de todo el mundo (Tabla 2.3). Para esto último se incluyeron, además de los ejemplares medidos para esta Tesis (47 especímenes de 13 especies de musteloideos de colecciones argentinas, ver Apéndices 2.3, 2.4), datos de varias fuentes bibliográficas clásicas (Mivart 1885, Slijper 1946, Davis 1964, Holmes 1980, Van Valkenburgh 1987, Iwaniuk 1999). Mivart (1885) y Davis (1964) proveyeron medidas lineales crudas y relativizadas de las longitudes de las principales regiones de la columna, principales huesos largos, metacarpal III, metatarsal III y falange III de la mano para 18 especies de musteloideos. Slijper (1946) presentó medidas lineales crudas y relativizadas del sector axial. Holmes (1980), Van Valkenburgh (1987), e Iwaniuk (1999) publicaron medidas relativizadas de los miembros.

Las especies fueron categorizadas en clases dietarias y locomotoras (Tabla 2.4). La definición de las clases dietarias, y la pertenencia de cada especie a cada una de ellas, fueron definidas siguiendo principalmente a Prevosti et al. (2012), y secundariamente otras fuentes bibliográficas para la asignación de algunas especies (Bassariscus astutus, Eira barbara y

Taxidea taxus; Poglayen-Neuwall y Toweill 1988, Goodrich y Burskirk 1998, Johnson et al.

2000, Meloro y O´Higgins 2011). Sin embargo, las categorías planteadas por estos autores fueron simplificadas, fusionadas en categorías más abarcadoras por conveniencias inherentes a los análisis aquí presentados y la escasa representación de algunas de las categorías originales. La categoría "Carnívoro" (coincidente con "hipercarnívoro" y "mesocarnívoro" de Prevosti et al. 2012), incluyó carnívoros que consumen preferentemente carne; y la categoría "Omnívoro" ("omnívoro", "insectívoro" y "herbívoro" de Prevosti et al. 2012) incluyó a especies en los que plantas o invertebrados fueron una porción mayoritaria de la dieta, o lo único consumido por la especie. Las clases locomotoras son propias de este trabajo, pero inspiradas principalmente en Álvarez et al. (2013) y secundariamente otras fuentes (e.g., Schutz y Guralnick 2007). Se utilizaron las clases: "half-bounder" para animales que realizan carreras asimétricas, en quienes los movimientos de flexo-extensión de la columna son un propulsor activo y ambos miembros posteriores se encuentran en fase durante la propulsión; "trepador" para especies que utilizan frecuentemente el sustrato arbóreo (incluyendo a arborícolas estrictos); "cavador" para especies que frecuentemente cavan en búsqueda de alimento o refugio; y "nadador" para el caso de especies que frecuentemente nadan y realizan buceo (exclusivamente nutrias). La pertenencia de cada especie a cada categoría siguió estas fuentes, y la bibliografía mencionada en el apartado de Diversidad ecológica y funcional de los mustélidos de la introducción (ver Tabla 2.4). Para el caso de algunas especies (e.g., Lyncodon patagonicus), la asignación a una u otra categoría puede ser discutible por falta de datos ecológicos, o por la naturaleza de los hábitos diversos de una especie en particular. Por ello en algunos casos y análisis puntuales, se ensayaron diferentes clasificaciones (ver aclaraciones en Tabla 2.4, sección 3.4), con el fin de evaluar potenciales modificaciones en los resultados estadísticos. Lyncodon patagonicus, en función de lo poco que

se conoce de la especie (e.g., Doering 1881, Koslowsky 1904, Cabrera y Yepes 1940, Prevosti y Pardiñas 2001, Teta et al. 2008, Wilson y Mittermeier 2009), fue tentativamente asignado a dietas carnívoras y hábitos locomotores half-bound, aunque el comportamiento del taxón en los análisis fue analizado con cautela y se ensayó la eliminación del taxón en algunos análisis particulares. El mismo esquema de clasificaciones y procedimiento de asignación fue aplicado a los análisis de morfometría geométrica.

Vale la pena destacar que, aunque estas categorías sean denominadas en forma simplificada como locomotoras, existe una amplia discusión metodológica y específicamente terminológica al respecto. Miljutin (2009) sugiere que no deben ser confundidos los medios o sustratos de locomoción (e.g., acuático, subterráneo, terrestre, arbóreo, aéreo) con las principales especializaciones al uso de estos sustratos (e.g., nadador, cavador, cursorial, trepador, volador). También plantea contemplar la diferencia en el sustrato utilizado tanto durante el forrajeo como en el descanso. Siguiendo a este autor, la definición de categorías locomotoras planteadas en esta Tesis no responden exclusivamente a estilos locomotores, sino a una combinación sintética de estilos locomotores y usos de sustratos (ver Miljutin 2009). Por otro lado, en el caso del grupo de estudio analizado y diseño de categorías planteadas, la diferenciación entre el concepto "acuático" y "nadador" es teórico, dado que todas las especies de carnívoros musteloideos que se desplazan principalmente en el medio acuático lo hacen mediante el nado, y algo similar puede plantearse para el caso del sustrato arbóreo y el trepado. Vale la pena también destacar que, en función de la definición brindada en este trabajo, las categorías "cavador" y "half-bounder" corresponden a dos estrategias ecológicas diferentes enmarcadas dentro de la categoría de uso de sustrato terrestre, dado que los carnívoros cavadores no utilizan el cavado como medio principal de locomoción, sino como una forma de búsqueda de refugio o presas. De esta manera, la categoría "cavador" no responde específicamente a un estilo locomotor o uso de sustrato específico, aunque en el caso específico de los carnívoros, las especies aquí denominadas como cavadoras se asemejen tanto en estilo locomotor (marchas lentas, galope) como sustrato de locomoción (principalmente terrestres).

A partir de estos datos se realizaron análisis de la varianza (ANOVA) de uno y dos factores, utilizando como variables categóricas independientes a los hábitos dietarios y locomotores. Para el caso de los índices que incluyeron la región cervical o elementos del miembro anterior (i.e., LaTL/PrLaM, LaCe/LaTL, LaMA/LaMP, LaRa/LaHu, LaMcIII/LaFIII), regiones influenciadas marcadamente por el factor dieta según estudios previos (ver Bisaillon et al. 1976, Iwaniuk et al. 1999, 2000, Samuels et al. 2013), la variable dieta fue incluida dentro de las variables explicativas y se construyeron funciones de dos factores. Para los restantes índices (i.e., LaLu/LaTL, LaSC/LaTL LaTi/LaFe) se consideró sólo a la variable locomoción como potencial factor explicativo, y se realizaron análisis de dos factores. Se evaluaron los

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supuestos de la homocedasticidad (test de Levene) y normalidad de los residuos (test de Shapiro-Wilk). Mediante ANOVAs de dos factores, se evaluó la significancia del efecto de cada factor y su interacción (i.e., A+B+A*B). Los factores significativos se utilizaron para construir ANOVAs menos inclusivos (e.g., A o A+A*B). En el caso de que ninguno de los efectos fuese significativo en la función más incluyente, se evaluó también la significancia eliminando el efecto interacción (i.e., A+B), y finalmente a cada factor por separado (i.e., A o B). En resultados significativos para la variable "hábitos locomotores", se realizaron test a posteriori de Bonferroni para chequear diferencias entre pares de grupos. En casos puntuales de análisis no significativos con presencia de taxones outliers, los análisis fueron realizados nuevamente eliminando/modificando de grupo al taxón problemático dependiendo el caso (ver sección 3.4). Los valores de los índices obtenidos para cada grupo fueron analizados también mediante estadística descriptiva básica (e.g., media, cuartiles, rango, desvío estándar) y graficados mediante esquemas de cajas (box-plots).

Con el fin de tener en cuenta la estructura filogenética de los datos y la influencia del tamaño en la relación entre hábitos locomotores y dietarios en cada índice, se realizaron ANCOVAs filogenéticos de 1 y 2 factores utilizando GEE (Generalized Estimating Equations; Paradis y Claude 2002; ver también Morgan 2009, Cassini 2013), método derivado de regresiones de tipo Phylogenetic Generalized Least Squares regression model (PGLS; Martins y Hansen 1997, Paradis y Claude 2002); coneste método se re-analizaron las relaciones entre los factores y los índices.

Se utilizó al logaritmo natural de la masa corporal de cada especie como covariable. Los valores de masa corporal de cada especie fueron obtenidos de varias fuentes (ver Tabla 2.4), siguiendo principalmente la recopilación de Johnson et al. (2000). La estructura filogenética se obtuvo a partir de un árbol de relaciones filogenéticas combinado a partir de filogenias moleculares recientes, siendo la fuente principal Sato et al. (2012) (relaciones intra-familiares de Mustelidae; ver Fig. 1.1), y secundariamente: Koepfli et al. (2007) (intra-familiares de Procyonidae), Harding y Smith (2009) (relaciones intra-subfamiliares de Mustelinae no presentes en Sato et al. 2012), Eizirik et al. (2010) (relaciones inter-familiares, relaciones intra- familiares de Mephitidae), Koepfli et al. (2008) (relaciones intra-subfamiliares de Guloninae no presentes en Sato et al. 2012), y Agnarsson et al. (2010) (posicionamiento de lutrinos no presentes en Sato et al. 2012, e.g., Lontra provocax). Se estandarizó el largo de rama en 1.

El procedimiento de análisis para los ANCOVAs filogenéticos fue similar al realizado para los ANOVAs. En una primera instancia, se construyeron funciones con el total de los factores y la covariable (Covariable+A+B). En caso de no encontrarse una relación significativa entre la covariable y la variable explicada, se eliminó a la primera y se continuó con ANOVAs filogenéticos. En caso de que un factor no sea significativo, se eliminó también de las variables

explicativas, presentándose finalmente la función ANCOVA o ANOVA filogenética menos inclusiva que incluya el total de los factores significativos. Debido a limitantes de los grados de libertad de las funciones, no fueron analizadas las interacciones entre factores en este procedimiento (casi universalmente insignificantes, ver sección 3.4).

Los análisis fueron realizados en R (versión 3.0.3; R Development Core Team 2013), y los paquetes "car" (Fox y Weisberg 2011), "mvnormtest" (Jarek 2009) y "ape" (Paradis et al.

2004).

2.2.3.3. Análisis cuantitativo de morfometría geométrica: La técnica morfometría geométrica

permite, a partir de imágenes, e independizándose del efecto geométrico del tamaño, la rotación y la traslación, el estudio de los cambios de forma entre los objetos en estudio (mediante el análisis generalizado de Procrustes; Goodall 1991, Rohlf 1999).

Para cada análisis de morfometría geométrica de dos dimensiones, son necesarias fotografías orientadas y con escala. Sobre ellas se indican puntos anatómicos de referencia (landmarks), que son definidos con criterios de homología biológica, o geométrica (Barcinová 2009, Mitteroecker y Gunz 2009). Los semi-landmarks son un tipo de landmarks definidos con un criterio de homología más flexible. Estos poseen una mayor libertad de posicionamiento, y permiten trabajar con márgenes o superficies homólogas, cuando no es posible ubicar

landmarks. Al conjunto de las coordenadas espaciales de los landmarks utilizados para representar la forma de un objeto se los denomina configuración de landmarks (Barcinová 2009, Mitteroecker y Gunz 2009).

Para el análisis de forma, las configuraciones de landmarks de todos los especímenes son superpuestas utilizando un análisis generalizado de Procrustes (GPA o Generalized Procrustes Analysis; Goodall 1991, Rohlf 1999), procedimiento que permite eliminar los efectos de traslación, rotación y escala, quedando el cambio de forma como único causante de las diferencias entre coordenadas de landmarks homólogos entre los distintos especímenes. Estos datos son volcados a las matrices de coordenadas de especímenes alineados. El espacio de especímenes alineados es no lineal (i.e., es curvo) y debe ser proyectado a un espacio lineal para luego poder realizar Análisis de Componentes Principales, que permitan resumir en ejes independientes los principales cambios de forma de la muestra (ver Barcinová 2009, Mitteroecker y Gunz 2009, y sus citas para un resumen del método). Para este estudio se utilizaron materiales de las colecciones nacionales y extranjeras mencionadas (ver Apéndice 2.5). La digitalización de landmarks fue llevada a cabo en el tpsDig 2.10 (Rohlf 2013a), y la edición de archivos en el tpsUtil 1.56 (Rohlf 2013b); se utilizaron tanto landmarks como semi- landmarks (Fig. 2.1, Apéndice 2.6). Las vistas analizadas fueron: lateral del axis, dorsal de penúltima vértebra lumbar, craneal del extremo distal del húmero, y caudal del extremo

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proximal del fémur (Fig. 2.1). Se seleccionó la penúltima vértebra lumbar dado que las últimas vértebras lumbares presentan los rasgos de interés funcional (e.g., desarrollo de procesos de inserción muscular) más desarrollados, y se evitó el último elemento debido a que la morfología del mismo suele estar afectado por el escaso espacio entre iliones, alejándose de la morfología lumbar típica para la especie.

A partir de las coordenadas alineadas por espécimen, se construyeron coordenadas alineadas consenso por especie. Desde estas últimas se construyeron coordenadas consenso por cada grupo locomotor y dietario. A partir de estas matrices, se realizaron Análisis de Componentes Principales por grupos (between-groups PCA; Mitteroecker y Bookstein 2011). Para cada una de estas matrices (i.e., coordenadas consenso de los grupos locomotores y coordenadas consenso de los grupos dietarios), se obtuvieron las matrices de autovectores correspondientes, calculadas a partir de las matrices de varianza-covarianza entre grupos (locomotores o dietarios). Posteriormente a esto, los datos de forma promedio por especie son proyectados sobre estos autovectores, obteniéndose la maximización de separación de los grupos predefinidos en los primeros ejes sin modificarse las posiciones relativas de las especies en el morfo-espacio. Este procedimiento implica una ventaja sobre el Análisis de Componentes Principales tradicional cuando el objetivo es diferenciar grupos conocidos a priori, dado que en este último tipo de análisis los primeros ejes sintetizan la máxima separación entre muestras (e.g., especies), en vez de maximizar las diferencias entre los grupos de interés. Las coordenadas resultantes de la proyección fueron utilizadas como variables explicativas en regresiones contra las coordenadas alineadas promedio por especie, con el fin de reconstruir las grillas de deformación del morfoespacio y obtener el porcentaje de variación de forma explicada por cada eje del between-group PCA mediante el programa tpsRegr 1.38 (Rohlf 2011). Las coordenadas proyectadas fueron a su vez utilizadas como variables dependientes en análisis de varianza univariados contemplando o no la estructura filogenética y el efecto alométrico (i.e., ANOVAs sin control filogenético y ANCOVAs filogenéticos, en el caso de los análisis de la variable dieta), y multivariados (i.e., MANOVAs sin control filogenético y MANCOVAs filogenéticos, en el caso de los análisis de la variable locomoción), con el fin de evaluar la significancia del efecto de la locomoción y la dieta sobre estas variables de forma, en un procedimiento análogo al aplicado en los índices lineales, utilizando las mismas variables independientes y covariable ya comentadas (ver Tabla 2.4), y utilizando el mismo software (i.e., R versión 3.0.3; R development core team 2013; ver sección 2.2.5).