Análisis de datos

El gen Act fue usado como gen normalizador para la evaluación de la expresión de genes de  defensa mediante el método de Ct comparativo, también conocido como 2‐ΔΔCt (Schmittgen &  Livak 2008). A partir de los valores Ct obtenidos para cada uno de los genes de defensa evaluados,  se realizó la cuantificación de los niveles de expresión de genes en las plantas en relación con la  aplicación de ASM en cada uno de los días de ensayo. Los cálculos se realizaron a partir de la  fórmulas propuestas por Livak & Schmittgen (2001).  

A partir de estos datos, se realizó un análisis de varianza ANOVA de una vía, para determinar el  tratamiento que presentó mayor inducción de genes de defensa. Los valores obtenidos fueron  graficados en el programa Microcal Origin 6. 

6.3 RESULTADOS Y DISCUSIÓN 

Para la evaluación de las respuestas de defensa inducidas por ASM, se tuvieron en cuenta cuatro  diferentes genes, cada uno de ellos involucrados en las rutas de señalización de AS, AJ, ROS y  síntesis de compuestos fenólicos.  

En las plantas de uchuva tratadas con ASM se presentó aumento en la expresión del gen CHI  (Figura 6.1a), el cual está relacionado con la señalización por AS. Este resultado concuerda con los  de Whan et al (2009), donde se determina que la aplicación foliar del fitoactivador ASM aumenta  la expresión de genes PR, que codifican las enzimas de quitinasa y β‐1,3 glucanasa. La inducción  del gen CHI en tejido de raíz por BTH (Burketová et al. 2003) es indispensable para el control del  marchitamiento vascular puesto que la entrada del patógeno se da a través de las raíces, así que la  posterior traducción de quitinasa disminuirá el desarrollo del patógeno en la planta por el ataque  directamente a su pared celular (Pereira et al. 2013). 

Figura 6.1. Cambio en la expresión de genes de defensa relacionados con la señalización por AS y AJ en  plantas de uchuva respecto a cada uno de los tiempos evaluados. a. Gen CHI, asociado a la ruta de  señalización de AS (p<0.001). b. Gen AC, asociado a la ruta de señalización por AJ (p<0.001). En ambos casos,  la gráfica interna muestra los puntos más bajos en el cambio de la expresión de cada uno de los genes. El 

símbolo muestra el día donde se presenta la diferencia estadísticamente significativa por comparación de 

medias de Duncan. Las barras representan el error estándar.   

Cabe resaltar que el aumento en la expresión de CHI a partir de la segunda aplicación de ASM,  específicamente el día 8 (p<0.001), estableciendo una mayor inducción de RSA cuando la  aplicación del fitoactivador es constante. Esto se puede comparar con lo reportado por Herman et  al (2007), quienes realizaron dos aspersiones de ASM bajo el mismo esquema de este trabajo (día 

0 y 7) y demostraron que después de la segunda aspersión el incremento en la expresión de genes  PR‐1 resultó ser el doble comparado con la primera aspersión, y aclaran que la activación de  respuestas de defensa mediadas por AS, siguen un patrón similar a las dos aplicaciones de ASM  alcanzando altos niveles de inducción de defensa. 

Por otro lado, el cambio en la expresión del gen AC en las plantas que fueron tratadas con ASM fue  variable durante el ensayo, aunque el análisis estadístico muestra diferencias significativas en la  expresión en los días 1 y 10 (figura 6.1b). En este caso AC determina de manera indirecta la  señalización de AJ por la aplicación de ASM, encontrando que el fitoactivador bloqueo la  señalización de esta molécula. En la inducción de RSA, cuando se presenta un exceso de AS, los  genes de defensa inducidos por AJ no se expresan (Pieterse et al. 2009). 

El aumento en la expresión de este gen posterior a la segunda aspersión del fitoactivador, otorga a  la planta ventajas en caso que se presente una posible interacción compatible con el patógeno,  esto se compara con lo propuesto por Restrepo et al (2005), donde demostraron que al silenciar el  gen AC, la señalización de AJ se limita y la planta presenta mayor susceptibilidad a la enfermedad.   Por otro lado, el gen de AC también está relacionado con la fotosíntesis, puesto que codifica la  enzima responsable de la conversión reversible del HCO‐3 a CO2, sustrato de la enzima rubisco,  contribuyendo así a la eficiente asimilación de carbono inorgánico para las primeras reacciones de  carboxilación en la fotosíntesis (Hoang & Chapman 2002), además, se ha determinado que se  presenta una subexpresión de este gen cuando hay un exceso de dióxido de carbono, como  consecuencia de estrés biótico o abiótico (Jaramillo 2013).  

El cambio en la expresión del gen POX no es evidente con la primera aspersión de ASM (Figura  6.2), solo se muestra un leve aumento en la expresión en las plantas control al día 0 y 7, luego de  la segunda aspersión del fitoactivador se presentaron los máximos niveles de expresión de este  gen (día 8 y día9). Se ha establecido que la rápida producción de H2O2 es uno de los primeros 

eventos dentro de la interacción planta‐patógeno (Cao et al. 2005), evidencia de ello es el trabajo  de Cools & Ishi (2002), en el que probaron la inducción de este gen en plantas de pepino bajo dos  tratamientos,  aspersión  de  ASM  y  plantas  previamente  tratadas  con  ASM  e  inoculadas  posteriormente con Colletotrichum orbiculare; para el primer tratamiento el nivel máximo en la  expresión de POX se alcanzó 72 horas después de la primera aspersión, mientras que para el  segundo tratamiento, en la hora 3 de evaluación, se alcanzaron valores de expresión superiores al 

manera más rápida la expresión del gen peroxidasa. En este trabajo, el aumento de la expresión  posterior a la segunda aspersión de ASM posiblemente se debe la acumulación del compuesto en  las plantas y, además, puede tener relación directa con la inducción de otras rutas de señalización,  por ejemplo la síntesis de compuestos como lignina y suberina, barreras de defensa, en las que  están implicadas peroxidasas (Radhakrishnan et al. 2011). 

. 

Figura 6.2 Evaluación de la expresión del gen POX, como parte de la respuesta a estrés oxidativo (ROS). La 

gráfica interna muestra los puntos más bajos en el cambio de la expresión (p=0.031). Los niveles de 

expresión génica se presentan en cantidades relativas normalizadas con el gen Act. Los símbolos muestran el  día donde se presenta diferencia estadísticamente significativa a partir del análisis ANOVA y comparación de  medias de Duncan. Las barras de error representan el error estándar.  

En cuanto a la expresión del gen PAL‐1, el aumento en la expresión se presentó a partir del día 7  en las plantas tratadas con ASM (Figura 6.3), sin embargo, Giberti et al (2012), determina que un  rápido aumento en la expresión del gen PAL, representa una respuesta temprana en la planta  frente a la penetración de los patógenos, así como la aplicación de elicitores tanto bióticos, como  los fúngicos, y abióticos como en este caso ASM, logran inducir de manera más efectiva la  expresión del gen PAL.  

En estudios realizados por Cools & Ishi (2002) explican que el aumento en la expresión del gen  PAL‐1 está condicionado a la presencia del patógeno, puesto que en plantas de pepino que  tuvieron aplicación de ASM y que posteriormente tuvieron contacto con el patógeno, el cambio en 

la expresión de este gen fue inmediata, comparado con plantas que solo tuvieron aplicación de  ASM y que no presentaron cambio en la expresión de PAL‐1; así mismo, Whang et al (2008),  determinaron el aumento en la expresión de genes CHI y POX en relación con la aplicación de  ASM, mientras que la expresión de PAL‐1 solo fue evidente en plantas tratadas con ASM pero que  posteriormente estuvieron en contacto con el patógeno. 

La inducción del gen PAL‐1 se relaciona con el contenido de polifenofenoles en condiciones de  estrés o normales para la planta; la correspondencia entre el nivel de expresión del gen y la  síntesis de metabolitos sugiere que esta enzima está regulada (André et al. 2009) en este caso, las  aplicaciones sucesivas de ASM inducen el aumento de expresión del gen, seguida de una posible  acumulación de compuestos fenólicos en la planta. 

Figura 6.3 Evaluación de la expresión del gen PAL‐1, como parte de ruta de síntesis de fenilpropanoides  (p<0.001). La gráfica interna muestra los puntos más bajos en el cambio de la expresión. Los niveles de  expresión génica se presentan en cantidades relativas normalizadas con el gen Act Los símbolos muestran el  día donde se presenta diferencia estadísticamente significativa a partir del análisis ANOVA y comparación de  medias de Duncan. Las barras de error representan el error estándar.  

A partir del cambio en la expresión de los genes evaluados, se determinó la inducción efectiva de  RSA en las plantas de uchuva que tuvieron aplicaciones de ASM comparado con el tratamiento  control, que en todos los casos tuvo menores niveles de expresión de genes de defensa.  

fitoactivador, sin embargo esta inducción puede estar relacionada con las dosis de aplicación en el  tiempo, lo cual se demuestra en la mayoría de los casos a partir de la segunda aplicación, donde  posiblemente por acumulación del compuesto se presenta un aumento evidente en la expresión  de los genes de defensa  

Así mismo se muestra una relación en la expresión de estos genes y el control del marchitamiento  vascular  causado por  F. oxysporum en relación  con  la disminución  de la severidad de  la  enfermedad  a  partir  de las  aplicaciones  seguidas del  fitoactivador las cuales  demostraron  disminuir la severidad de la enfermedad e inducir la expresión de genes de defensa. 

7. DISCUSIÓN GENERAL 

Teniendo en cuenta la importancia del cultivo de uchuva en Colombia, el cual se posiciona como el  fruto exótico con mayor porcentaje de exportación (60%) (Legiscomex 2013), es importante  mantener altos índices de calidad en el producto, lo que se relaciona directamente con el manejo  del cultivo. El control de enfermedades presentadas durante el desarrollo del cultivo de uchuva se  centra en la aplicación de plaguicidas y fungicidas, pero estos no tienen el efecto esperado en su  control, como es  el  caso del marchitamiento vascular, causado por F.  oxysporum (Zapata  2007)(Díaz et al. 2012). 

Cuando se requiere implementar un programa de control de enfermedades a partir de productos  de síntesis química, ya sean plaguicidas, fungicidas, reguladores fisiológicos e incluso fertilizantes,  es necesario establecer previamente la respuesta de la planta a dichos productos, puesto que en  muchos casos su aplicación puede generar toxicidad en algunas especies vegetales. Por tal motivo,  la primera parte del proyecto se enfocó en determinar el método, concentración y dosis de  aplicación de ASM en plantas de uchuva. Los resultados analizados para cada una de las variables  previamente reportadas por Mejía (2010) y Rozo (2011), determinaron que la aplicación del  fitoactivador en drench causa toxicidad en las plantas de uchuva. La toxicidad por ASM impide la  eficiente síntesis de compuestos fenólicos en la planta (Dufour et al. 2013), por lo cual la esta no  tiene la capacidad de sintetizar de manera eficaz diferentes compuestos relacionados con barreras  estructurales y de defensa. Por otro lado, la aplicación foliar del fitoactivador en concentración de  15mg_·L‐1 _{resultó no ser tóxica para las plantas de uchuva, este tipo de aplicaciones garantizan la}  efectiva translocación del compuesto desde la porción aérea hasta las raíces (Prats et al. 2002), lo  cual resulta importante, puesto que el activar las respuestas de defensa en toda la planta otorga  ventajas en caso de un ataque de patógenos, bien sea foliares o radicales, como es caso de F. 

oxysporum. 

Los mecanismos de inducción de defensa en plantas de uchuva tienen que garantizar el control de  varias enfermedades, por lo cual se buscan tratamientos que garanticen la completa inducción de  defensas. Los resultados obtenidos en el análisis de expresión de genes de defensa explican que  este fitoactivador activa y aumenta la expresión de diferentes genes que codifican enzimas  relacionadas con defensa y otorga a la planta la capacidad de protegerse, posiblemente frente a  un amplio espectro de patógenos. En el caso de ASM, se ha comprobado que a partir de 

patógenos, es el caso de plantas de pepino frente a Pythium sp., causante de dampping off  (Burketová et al. 2003). En este trabajo se comprobó que la aspersión foliar logró inducir las  respuestas de defensa frente a F. oxysporum, el cual inicia el proceso de infección a través de  raíces, y se presentó disminución en un 79% en el porcentaje relativo de severidad de la  enfermedad, en el tratamiento con frecuencia de aplicación los días 0‐14‐28. Además, es posible  que este tipo de protección se mantenga en el caso de patógenos foliares que afectan las plantas  de uchuva, como es el caso de Phoma sp. o Alternaria sp., entre otros, dado que la expresión de  genes de defensa también se aumentó en tejido foliar; incluso se podría llegar a controlar el  desarrollo de enfermedades directamente en el fruto, como la causada por Botrytis sp.  

La relación entre el control de la enfermedad y la expresión de genes de defensa por aplicación de  ASM se determinó a partir de la disminución en los porcentajes de severidad de la enfermedad y el  aumento en la expresión de genes de defensa en plantas de uchuva. Este compuesto, al ser un  análogo funcional del AS, tiene la capacidad de aumentar la expresión de genes relacionados con  AS y consecuentemente induce RSA (Oostendorp et al. 2001). En este caso se presentó aumento  en la expresión del gen CHI, el cual determina la inducción efectiva de este tipo de resistencia  mediada por la molécula de AS; sin embargo, Zuluaga et al. (2013), establecieron que el aumento  en la expresión de este gen PR no solo está relacionado con la acumulación de AS sino también de  ET, a partir de la inducción de la enzima ACC‐oxidasa, por lo cual se puede determinar que la  aplicación de fitoactivadores como ASM no solo induce la señalización de una molécula, sino por el  contrario tiene la capacidad de promover la señalización de otro tipo de rutas en las plantas, que  al final confluyen en el aumento de la expresión de genes de defensa. 

En cuanto al gen POX, el cual hace parte del mecanismo de defensa de ROS, se encontró un  aumento en la expresión a partir de la segunda aplicación de ASM, lo cual coincide con   los  ensayos de patogenicidad, donde dos a tres aplicaciones en el tiempo disminuyen la severidad de  la enfermedad en más del 50%. Esto determina que la activación de ROS por ASM detiene el  avance del patógeno, en una primera línea de defensa dependiendo de las dosis. La producción de  ROS en la planta se ha determinado como la primera línea de defensa frente al patógeno, puesto  que tiene la capacidad de atacarlo directamente deteniendo así su ingreso a la planta, debido a  que estos compuestos son considerados citotóxicos (Malolepza 2006).  

La producción de ROS incluye enzimas peroxidasas, catalasas e iones superóxido, entre otros, que  tienen la capacidad de atacar al patógeno y de detener el avance de este por medio de la 

respuesta hipersensible o HR, lo cual se considera como el primer paso en la inducción de  resistencia (Doke et al. 1996). El aumento en la expresión de los genes CHI y PAL‐1 está  relacionado con la expresión de POX, este muestra cambio en la expresión al día 8 y de manera  simultánea, se presenta un aumento significativo en la expresión de CHI y PAL‐1, lo cual confirma  que primero se induce la respuesta asociada a la producción de ROS y posteriormente se induce la  síntesis de otros compuestos de defensa. En el caso del gen CHI, relacionado con la acumulación  de qutinasas para hidrolizar compuestos de la pared celular de los hongos, la inducción de la  expresión es tardía, día 8 luego de la primera aspersión de ASM. El aumento en la expresión de  este gen podría ser mayor que el obtenido en este estudio se evaluo bajo un modelo de  interacción con el patógeno, puesto que este gen se considera altamente específico en respuesta a  elicitores fúngicos patógenos en plantas (Pereira et al. 2013). Por otro lado, la acumulación de  compuestos sintetizados a partir de PAL‐1 y que hacen parte del metabolismo secundario, juegan  un papel importante en dentro de los mecanismos de defensa en las plantas y pueden ser  inducidos por la aplicación de ASM o de elicitores bióticos no patógenos (Doke et al. 1996)(Gray et  al. 2012). 

El control de la enfermedad a partir de la aplicación de ASM, se relaciona con la alta expresión de  los genes CHI y PAL‐1, así como la baja expresión en los genes POX y AC en respuesta a la  aplicación del fitoactivador. En los primeros dos genes, se demuestra que activa respuesta de  defensa en RSA, puesto que induce la síntesis de enzimas que controlan el ataque del patógeno a  partir de la hidrólisis de la pared celular con enzimas como quitinasas y además induce la síntesis  de barreras estructurales y demás compuestos asociados a la defensa de las plantas. En estudios  previos realizados en el grupo de investigación, se logró establecer que la aplicación de ASM  induce la síntesis de metabolitos secundarios tipo flavonoides, cumarinas y terpenos, los cuales  tuvieron  la  capacidad  de  inhibir  el  crecimiento  de  F.  oxysporum  a  partir  de  estructuras  germinativas en ensayos realizados en placa (Rozo 2011). Los otros genes evaluados, POX y AC,  aunque están relacionados con la respuesta de defensa, no son exclusivos de la respuesta de RSA,  es importante resaltar que el cambio en la expresión del gen POX se establece como una  respuesta general a cualquier estímulo externo al que esté sometida la planta (Pereira et al. 2013)  así mismo, la aplicación del fitoactivador puede inducir otras rutas de defensa como AJ y ROS, que  de igual manera son necesarias en la inducción de defensa en las plantas. 

rápida y constante en el tiempo cuando estas plantas son enfrentadas con el patógeno (Dufour et  al. 2013). Esto está relacionado con el control de la enfermedad a partir de aplicaciones de ASM  previas a la inoculación del patógeno, puesto que resulta importante resaltar que en plantas que  tuvieron solo una aplicación se evidencio un 22% de disminución de severidad la enfermedad, y el  porcentaje de control aumento en relación a las dosis del fitoactivador. Además, Mandal et al.  2009,  determinan  que  factores  exógenos  pueden  afectar  sustancialmente  la  fisiología  del  hospedero, llevando a una rápida y coordinada activación de los genes de defensa en plantas que  normalmente presentan susceptibilidad al ataque del patógeno.  

Finalmente, los resultados obtenidos en este proyecto establecen la relación directa entre el  control de la enfermedad causada por F. oxysporum y la expresión de los genes de defensa por la  aplicación de ASM, teniendo en cuenta que es necesario más de una aplicación del fitoactivador  para evidenciar el control de la enfermedad relacionado con el cambio en la expresión de los  genes de defensa. 

8. CONCLUSIONES 

 A partir de los parámetros de toxicidad establecidos previamente en plantas de uchuva, se  determinó que las variables de altura, número de hojas basales y número de hojas apicales,  explican el efecto tóxico en términos de costo fisiológico en las plantas de uchuva cuando se