Análisis de expresión

Se extrajo ARN de plántulas completas de 13 días crecidas en MS1/2 y se realizó un análisis transcriptómico mediante la tecnología de RNAseq. Este análisis reveló que la mutación fip1-1 produce cambios significativos de expresión en un elevado número de genes. Se identificaron un total de 1714 genes desregulados en el mutante fip1-1 (Fold

change >2,5; FDR<0,01), 791 de ellos sobre-expresados y 923 reprimidos (Figura 36).

Figura 36: Representación de los genes que sufren cambios en sus niveles de expresión en el fondo mutante fip1-1 con respecto a su control.

Se analizaron los genes desregulados por acumulación en categorías funcionales y se observó que, entre los genes sobreexpresados, hay un enriquecimiento significativo de genes implicados en desarrollo embrionario, organización de la pared celular y respuesta a hormonas, principalmente al ABA, y estreses como falta de agua, alta intensidad lumínica, REDOX o frío. Entre la función molecular destacan las proteínas constitutivas de pared celular, unión a lípidos o reservas nutricionales (Figura 37). En cuanto a los genes que se encuentran reprimidos a nivel transcripcional en el mutante fip1-1, destacan categorías de respuesta a hormonas (auxina, etileno, ácido jasmónico o ácido salicílico), así como a estrés biótico o herida (Figura 38)

Figura 37: Categorías funcionales enriquecidas entre los genes sobreexpresados en el fondo mutante

fip1-1 (pvalor <0,05)

Figura 38: Categorías funcionales enriquecidas entre los genes reprimidos en el fondo mutante fip1-1 (pvalor<0,05)

2.1.1. Análisis preliminar de poliadenilaciòn alternativa en el extremo 3’UTR.

Ya que la tecnología de secuenciación de RNAseq genera un elevado número de secuencias cortas que se pueden alinear con el genoma de referencia, es posible determinar, al menos parcialmente, la localización del posible sitio de poliadenilación y extensión del 3ÚTR. Por ello, Se hizo uso de las secuencias obtenidas en el RNASeq para realizar un análisis de la longitud del extremo 3’UTR de los tránscritos. Los datos se analizaron gen a gen mediante el protocolo DEXSeq y se identificaron un total de 132 genes con cambios en la longitud del 3’UTR con un nivel de significancia de FDR<0,01 (criterio estricto) y 818 con un nivel de significancia de pvalor<0,01 (criterio menos estricto). Se analizó el enriquecimiento en categorías funcionales y, entre el grupo seleccionado con el criterio menos estricto, se identificó una frecuencia significativa de genes relacionados con procesos metabólicos, movimiento microtubular y respuesta a cadmio y daño genético (Figura 39).

Figura 39: Categorías funcionales enriquecidas entre los genes que sufren alteraciones de la longitud del extremo 3’UTR en el fondo mutante fip1-1 (pvalor<0,05).

De forma paralela, se analizó la composición de los tránscritos maduros mediante el protocolo DEXSeq. Así, se pudieron determinar las diferencias en la acumulación de lecturas a lo largo de todo el ADN genómico entre fip1-1 y su correspondiente control. Con estos datos es posible identificar tránscritos con distinta longitud del extremo 3’UTR, lo que permitió determinar que el mutante fip1-1 tiene tendencia a seleccionar sitios de poliadenilaciòn más distales (3’UTR largo) con respecto al control (Figura 40).

Figura 40: Esquema de los posibles casos de poliadenilaciòn alternativa en el extremo 3’UTR. Se ha determinado el número de genes tienen distinta acumulaciòn de lecturas en el extremo 3’UTR en el fondo fip1-1 con respecto a su control con dos criterios estadísticos. (FDR<0,01 y p valor<0,01). La figura representa un esquema de ARN mensajero con PAS alternativos, bajo los que se puede observar el porcentaje de genes que experimentan PAS en sitios distales y proximales en fip1-1 respecto al control.

Por último, el análisis de las secuencias del extremo 3’UTR de los mensajeros maduros permitió determinar la secuencia del sitio de corte y poliadenilación (Poly(A)site, PAS). Se analizó la frecuencia en la que aparecen los distintos nucleótidos en las coordenadas adyacentes al sitio de corte y se observó que el mutante fip1-1 presenta distinta frecuencia del uso de adeninas y timinas entre los puntos -15 y -25 del PAS, tomando como 0 el punto exacto del corte (Figura 41A). Este resultado supone un cambio en la secuencia seleccionada por la maquinaria de poliadenilación para realizar el corte del mensajero inmaduro, por lo que se analizó la frecuencia del uso de las secuencias canónicas de

Arabidopsis thaliana. Los resultados se muestran en la Figura 41B y confirman la reducción

del uso de las secuencias canónicas analizadas. A)

B)

Figura 41: PAS seleccionados en fip1-1 y su control. A) La frecuencia de cada uno de los nucleótidos según su posición relativa al sitio de corte y poliadenilación (YA, 0) se expresa en líneas de distintos colores. Se han destacado las frecuencias de Adeninas (azul) y Timinas (rojo) para facilitar la lectura de la región situada en el intervalo (-30, -10). B) Frecuencia del uso de las secuencias NUE más frecuentes en Arabidopsis en los fondos fip1-1 y control.

Una vez realizado el abordaje descriptivo, se trató de relacionar el uso de sitios de poliadenilación alternativa con los resultados obtenidos del análisis de los niveles de expresión. Se ha observado que la gran mayoría de los genes que sufren poliadenilación alternativa en el mutante fip1-1 no experimentan cambios en su expresión y los que sí lo hacen se encuentran equitativamente repartidos entre los inducidos y los reprimidos (Figura 42)

Figura 42: Genes coincidentes entre aquellos que se encuentran desregulados en fip1-1 y los que sufren APA según los dos criterios estadísticos establecidos. Diagramas de Venn realizados mediante la aplicación Venny (http://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/).