A partir de la secuencia del ADNc de segunda cadena de Aspergillus oryzae N74 se predijo la secuencia de la proteína FTasa (Fig. 17). Se encontró que la proteína esta compuesta por 525 aminoácidos, un punto isoeléctrico de 4,83 y un índice de hidropaticidad de ‐0,292. Adicionalmente la proteína presenta 6 puntos potenciales de N‐glicosilación y un péptido señal de 17 aminoácidos, el cual es removido por la enzima peptidiltransferasa entre los residuos AQA‐AS (Tabla 7, Fig. 17).
Como se menciono anteriormente, la secuencia del gen ftasa de Aspergillus oryzae N74 presenta 2 mutaciones de cambio de sentido con respecto a la secuencia a la secuencia RIB 40, se encontró que los aminoácidos sustituidos se encuentran en las posiciones p.L223F y p.V270A. Con respecto a la mutación de cambio de sentido con la secuencia FTasa de la cepa GX0015 la sustitución ocurrió en p.N155I.
El análisis de similaridad comparando la secuencia de Aspergillus oryzae N74 con las secuencias de Aspergillus oryzae GX0015, GX0010 y RIB 40, mostró porcentajes del 99, 36 y 99 respectivamente. Estos resultados muestran el alto grado de conservación de la secuencia entre las cepas Aspergillus oryzae RIB 40, GX0015 y N74 soportando así los resultados obtenidos en el análisis con la secuencia del gen. Como se observó en los análisis del gen, la secuencia de la cepa GX0010 no presentó valores altos de similaridad con respecto a las cepas GX0015, RIB 40 y N74. A diferencia de esto se evidenció que la cepa GX0010 es 100% similar a la secuencia de Aspergillus foetidus NRRL 337.
El análisis indicó que la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 presenta valores de similitud del 13%, 34%, 14%, 69% y 11‐15% con respecto a las secuencias reportadas para esta enzima en cepas de Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus foetidus NRRL 337, Aspergillus sydowi IAM2544, Aspergillus fumigatus AF293 y Aspergillus níger B60, IBT10SB y CBS 513.88, respectivamente.
Los análisis realizados para determinar las constantes físicas y moleculares de las secuencias FTasa, mostraron que las secuencias de las cepas RIB 40, GX0015 y N74 presentan las mismas características. Sin embargo el índice de hidropaticidad entre las tres secuencias fue diferente (Tabla 7), lo que se puede deber a las variaciones en los aminoácidos descritas anteriormente, las cuales afectan las condiciones de solubilidad de las proteínas. Como se observa en la Tabla
7, con respecto a las cepa A. oryzae N74 y A. oryzae RIB 40 la que mas alto índice de hidropaticidad presento fue GX0015 (‐0,285), este resultado sugiere que esta proteína es mas hidrofílica que la de A. oryzae N74 ya que la medida de hidropaticidad GRAVY (Grand Average of Hydropathy) esta dada en valores positivos para proteínas hidrofóbicas (Kyte et. al 1982). Este resultado también muestra que el cambio de una asparagina (N) por una isoleucina (I) en la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 puede tener un efecto sobre la solubilidad de la proteína o afectar considerablemente su estructura secundaria y terciaria.
Por otro lado la secuencia RIB 40 mostró tener un índice de hidropaticidad mas bajo con respecto a la secuencias de la cepa A. oryzae N74 (Tabla 7), lo que sugiere que la secuencia FTasa de A. oryzae N74 es mas hidrofílica que la secuencia de A. oryzae RIB 40 y que por lo tanto la actividad de esta proteina esta restringida a medios acuosos. Esto se debe a las dos sustituciones de aminoácidos presentes en la enzima de la cepa A. oryzae N74. Aunque ambos aminoácidos leucina (L) (presente en RIB 40) y fenilananina (F) (presente en N74) sean hidrofóbicos, en la escala de hidropaticidad propuesta por Kyte et al. 1982, la leucina presenta valores mas altos de hidrofóbicidad que fenilalanina. Esto mismo ocurre con el aminoácido valina (V) el cual fue sustituido en la secuencia de la cepa A. oryzae N74 por alanina (A).
Tabla 7. Constantes físicas y moleculares de las secuencias FTasas empleadas en el análisis. Convenciones: 1. A. terreus NIH2624, 2. A. foetidus NRRL 337, 3. A. sydowi IAM2544, 5. A. niger B60, 7. A. niger ATCC 20611, 9. A. niger IBT10SB, 10. A. oryzae GX0015, 11. A. fumigatus Af293, 12. A. oryzae GX0010, 13. A. oryzae RIB 40, 15. A. oryzae N74, 4‐6‐8‐14 A. niger CBS 51388.
Cuando la secuencias de la proteína FTasa de A. oryzae N74 fue comparada con secuencia de la cepa A. oryzae GX0010, se encontró que esta última presenta características tanto físicas como
moleculares diferentes a la secuencia de A. oryzae N74 (Tabla 7). Adicionalmente se encontró que todos los parámetros evaluados fueron idénticos entre la secuencia FTasa de Aspergillus oryzae GX0010 y la secuencias de Aspergillus foetidus NRRL 337 (Tabla 7). Estos resultados sugieren que las proteínas de la cepa A. oryzae GX0010 y A. foetius NRRL 337 podrian ser homologas y que por ende ambas cepas pudieron ser aisladas de ambientes similares.
La secuencia FTasa de Aspergillus oryzae N74 fue también comparada contra las secuencias de Aspergillus terreus NIH2624, Aspergillus sydowi IAM2544, Aspergillus fumigatus Af293 y Aspergillus niger ATCC 20611, B60 IBT10SB y CBS 51388. Se observó que los valores de pI e índice de hidropaticidad fueron variados, esto se debe a las diferencias en el número y la composición de aminoácidos de cada proteína.
Adicionalmente se encontró que las secuencias de las proteínas FTasa 4, 8 y 14, correspondientes a la cepa Aspergillus niger CBS 5138.8 carecen de péptido señal y de glicosilaciones, lo que coincide con lo reportado por Xiao L. et al. 2006 quienes sugieren que tanto la proteína 4 como la 8 son de tipo intracelular. En el caso de la secuencia 14, esta es una proteína hipotética obtenida de la secuenciación del genoma de Aspergillus oryzae CBS51388 (Pel H. et al. 2007) y a la fecha no existe ninguna descripción acerca de esta secuencia. Sin embargo, en este trabajo se sugiere que la proteína 14 debería ser de tipo intracelular por carecer de péptido señal y por la tanto de glicosilaciones. Con el objetivo de sugerir y analizar posibles relaciones de parentesco entre las secuencias FTasa empleadas se construyo un fenograma. Este análisis permitió establecer grupos taxonómicos basados en las relaciones de parentesco entre las secuencia (Fig. 18).
Figura 18. Fenograma de las secuencias FTasa agrupadas por parentesco. Casillas roja y negra
corresponden a grupos monofiléticos, Casillas amarilla, gris y azul grupos parafiléticos
36 El análisis usando el Fenograma mostró que las secuencias del las cepas A. oryzae GX0015, RIB 40 y N74 podrían establecer un grupo parafilético (casilla amarilla), y que así mismo la secuencias de A. oryzae GX0015 y N74 podrían pertenecen a un grupo monofilético. Adicionalmente se encontró que de estas secuencias, la mas distante de todas y que por ende podría ser la mas ancestral es la de A. oryzae RIB 40 y la más reciente la de A. oryzae GX0015, lo que se puede sugerir con base en los valores de distancia basados en la divergencia producida por el número de cambios o modificaciones entre las secuencias comparadas. La secuencia que se localizó mas cercana al grupo de las secuencias de Aspergillus oryzae fue la correspondiente a Aspergillus fumigatus Af293. Sin embargo, esta no fue incluida dentro del grupo de las secuencias de Aspergillus oryzae por presentar mas de dos posibles ancestros comunes. En el análisis fueron sugeridos adicionalmente dos grupos parafiléticos, el primero reunió las secuencias de las cepas de A. niger B60, IBT10SB y CBS 51388 (numero 6) (Casilla gris), el segundo grupo reunió las secuencias 14, 4 y 8 de la cepa de Aspergillus niger CBS 51388 (casilla azul). Este último grupo mostró contener las secuencias que posiblemente sean las mas recientes de todas las secuencias de Aspergillus niger, ya que las secuencias 14, 4 y 8 de CBS 51388 mostraron valores de divergencia superiores a los observados con las secuencias de A. niger B60, IBT10SB y CBS 51388 (numero 6). Finalmente, dos grupos monofiléticos fueron sugeridos en el primero se agrupan las secuencias Aspergillus terreus 2544 y de Aspergillus sydowi IAM 2544 (casilla roja), siendo esta última posiblemente la más reciente. El segundo grupo estuvo conformado por las secuencias de Aspergillus oryzae GX0010 y Aspergillus foetidus NRRL 337 las cuales no mostraron tener valores de divergencia entre ellas, lo cual coincide con los resultados de similaridad de las secuencias del gen y la proteína, así como también con los resultados de los análisis de las propiedades fisicoquímicas de las proteínas de estas dos cepas.
Finalmente de las secuencias empleadas en el análisis posiblemente la mas ancestral de todas es la cepa Aspergillus terreus ATCC 206111, ya que no fue agrupada con ninguna otra secuencia, adicionalmente mostró el menor valor de divergencia desde la raíz del árbol.