Análisis de las mutaciones a nivel proteico:

Las secuencias de ADN resultantes de cada mutante can1 se tradujeron bioinformáticamente para analizar posibles diferencias. En primer lugar, se determinaron las mutaciones por sustitución que producen cambios de aminoácidos, las sustituciones que provocan la generación de un codón de finalización de la traducción y las de corrimiento del marco de lectura. Este último grupo incluye las inserciones o eliminaciones de un nucleótido, las repeticiones directas y las inserciones o eliminaciones de varios nucleótidos. Es importante destacar que todas las mutantes generadas por corrimiento del marco de lectura, producen proteínas truncas no funcionales, debido a la generación de codones de terminación de la traducción tempranos, cercanos al sitio donde se produce el corrimiento.

Se compararon estos valores entre ambas cepas, conteniendo el vector vacío o expresando el dímero de Arabidopsis MutSγ. Se obtuvo una p=0,01 mediante la prueba

TABLA 6.13. Tabla de contingencia para las sustituciones de bases agrupadas según la probabilidad asociada a VDF.

YEP: muestras inducidas de cepas E134 transformadas con el plásmido vacío. MM: muestras expresando el heterodímero AtMSH2 y AtMSH7. (Ver detalles en el texto)

SUMA A SUMA B

YEP 3 12

125 exacta de Fisher según los datos de la tabla de contingencia 6.14, que se muestra a continuación.

Este resultado indica dependencia entre la expresión del heterodímero y la distribución de los distintos tipos de mutaciones analizadas. Al agrupar todas las mutaciones por sustituciones de bases en el ADN y compararlas con las alteraciones en el ADN que producen corrimientos del marco se obtiene una p=0,056, para la tabla de contingencia 6.15, observándose una muy leve asociación entre las variables.

Paralelamente, se analizaron las sustituciones de bases en el ADN, separadas en los dos grupos, según produzcan cambios en la identidad del aminoácido codificado o un codón de terminación de la traducción (tabla 6.16).

Se observa una diferencia entre la cepa control versus la que expresa AtMutSγ con una probabilidad asociada de 0,047. Este valor, si bien es consistente con una

Tabla 6.16. Tabla de contingencia. Secuencias mutantes can1 traducidas bioinformáticamente agrupadas según sustituciones que producen cambios de la identidad aminoacídica o codones de terminación.

YEP: colonias mutantes conteniendo el vector vacío. MM: colonias mutantes que expresan el dímero MutSγ.

Tabla 6.15. Tabla de contingencia. Secuencias mutantes can1 traducidas bioinformáticamente agrupadas según mutaciones por sustituciones de residuos aminoacídicos o corrimientos del marco de lectura.

YEP: colonias mutantes conteniendo el vector vacío. MM: colonias mutantes que expresan el dímero MutSγ.

Cambio de aminoácido Codón de terminación

YEP 4 8

MM 1 20

Sustituciones Corrimiento del marco de lectura

YEP 12 9

MM 21 4

Tabla 6.14. Tabla de contingencia. Secuencias mutantes can1 traducidas bioinformáticamente agrupadas según sustituciones de residuos aminoacídicos con generación de codón de terminación, sustituciones de residuos aminoacídicos que producen cambio de la identidad del aminoácido y corrimientos del marco de lectura.

YEP: colonias mutantes conteniendo el vector vacío. MM: colonias mutantes que expresan el dímero MutSγ.

Otras

Generación de codón de terminación Cambio de aminoácido Corrimiento del marco de lectura

YEP 4 8 9

MM 1 20 4

126 diferencia, está cercano al valor umbral, por lo que su significación no es decisiva, sino más bien indica una leve asociación de las variables.

Un hecho a tener en cuenta es que la cantidad de sustituciones de residuos aminoacídicos es menor que la cantidad total de bases mutadas en el ADN. Esto puede deberse a la presencia de colonias con más de una mutación, en las cuales, una de ellas puede producir un cambio a nivel del ADN sin alterar la identidad del aminoácido codificado. Adicionalmente, en los casos de mutaciones dobles donde una de ellas es un corrimiento del marco de lectura y la segunda una sustitución, sólo se contabiliza la sustitución en términos aminoacídicos, si se encuentra corriente arriba del sitio que provoca el corrimiento del marco. Esto se debe a que en todos los casos analizados de mutaciones por corrimiento del marco de lectura se generan codones de terminación de la traducción a corta distancia, generándose proteínas truncas no funcionales. Por lo tanto, cualquier mutación corriente abajo de estos sitios de terminación prematura no influirá en el fenotipo obtenido.

El análisis de las mutantes dobles reveló 2 sustituciones conservadoras y una sustitución corriente abajo de un IDL en el grupo control (YEp), y 2 sustituciones conservadoras y 3 sustituciones posteriores a IDL en el grupo que expresa MutSγ (MM). De esta forma, los resultados de sustituciones obtenidos en base a la secuencia nucleotídica condicen perfectamente con los resultados obtenidos mediante el análisis de las secuencias mutantes a nivel proteico.

Al analizar las mutaciones de sustitución que generan cambios en la identidad aminoacídica contra las demás, sumando las de corrimiento del marco y las sustituciones que generan codones de terminación, se obtiene una p=0,0061. Los valores analizados se pueden observar en la tabla de contingencia 6.17.

El resultado indica una fuerte dependencia de las variables, traduciéndose en un aumento en las mutaciones por cambios de identidad de nucleótidos versus las

Tabla 6.17. Tabla de contingencia. Secuencias mutantes can1 traducidas bioinformáticamente agrupadas según sustituciones que producen cambios de identidad de aminoácidos o codones de terminación por sustitución o corrimiento del marco de lectura.

YEP: colonias mutantes conteniendo el vector vacío. MM: colonias mutantes que expresan el dímero MutSγ.

Cambio de aminoácido Codón de terminación prematuro generado por sustituciones o corrimiento del marco

YEP 8 13

127 mutaciones que producen proteínas truncas, al expresar el dímero MutSγ. Cabe destacarse que las mutaciones pertenecientes al segundo grupo teóricamente producen siempre fenotipos mutantes, debido a una alteración grande de la secuencia proteica. Este hecho, ha sido considerado en trabajos anteriores (Lang y Murray, 2008). Por lo tanto, el resultado hallado sugiere que la diferencia entre las cepas, en cuanto a la distribución de mutaciones por sustitución de bases se debe principalmente al tipo de sustitución que produce cambios de aminoácidos. Este resultado es lógico y condice con los obtenidos por análisis de cambios en el ADN, donde se puede observar un patrón distinto en la distribución de sustituciones y otras mutaciones para los grupos control y expresando AtMutSγ.

En base a estos resultados, se puede concluir que al expresar AtMutSγ se produce un aumento en las mutaciones que producen cambios en la identidad de residuos aminoacídicos en comparación con el grupo control. Finalmente, este tipo de mutaciones son las responsables del aumento de las tasas de mutaciones generales observados en los ensayos de fluctuación.

128

6.9. Discusión:

Ante la necesidad de generar un sistema de expresión de AtMSH2 y AtMSH7 de forma recombinante que permitiese la realización de estudios tanto in vitro como in vivo

se optimizó la expresión de las proteínas de la planta A. thaliana en distintas cepas de levaduras.