Análisis de las dosis seminales

57

MATERIAL Y MÉTODOS

células conforme se las hace pasar a través de un rayo de luz láser. Para ello es necesario que en el citómetro de flujo las células, espermatozoides en este caso, pasen una a una delante del láser. Al atravesar el rayo láser los espermatozoides interaccionan con éste causando dispersión de la luz. Midiendo la dispersión de la luz en sentido frontal se obtiene el parámetro denominado Forward Scatter (FSC), que evalúa el tamaño de las células, y midiendo la dispersión de la luz de manera lateral se obtiene el parámetro denominado Side Scatter (SSC) que proporciona información de la complejidad celular. Estos parámetros permiten diferenciar los espermatozoides del resto de estructuras que también están presentes en las muestras en el momento de su análisis (debris). Además de señales de dispersión, mediante el citómetro de flujo también se recoge la fluorescencia emitida por los espermatozoides que han sido marcados previamente con distintas moléculas fluorescentes o fluorocromos. Los fluorocromos son sustancias químicas que al ser estimuladas con fotones con longitud de onda determinada (longitud de onda de excitación), emiten a su vez otro fotón con longitud de onda mayor (longitud de onda de emisión). La fluorescencia emitida por los espermatozoides teñidos con fluorocromos después de ser incididos por la fuente de luz láser del citómetro, es filtrada según su longitud de onda por los filtros del citómetro y recogida por los detectores de luz.

El citómetro empleado, tal y como se especifica en el aparatado 2.1.2. de material de laboratorio, posee 6 detectores. Dos detectores para señales de dispersión (FSC y SSC) y 4 detectores para señales de fluorescencia denominados FL1, FL2, FL3 y FL4. FL1 recoge una fluorescencia de 530±30nm, el detector FL2 585±42nm, el detector FL3 recoge longitudes de onda superiores a 670nm y el detector FL4 661±16nm. Además de los detectores otras piezas fundamentales en los citómetros de flujo son los espejos dicroicos que permiten la separación de la luz en función de su longitud de onda. El citómetro especificado en capítulo anterior posee 3 espejos dicroicos o dichroic mirror (DM), un DM 560 paso corto que sólo permite pasar una longitud inferior a 560nm, un DM 640 paso largo que sólo permite pasar una longitud superior a 640 nm, y un 670 DM de paso largo que sólo permite pasar una longitud superior a 670 nm.

Después del análisis realizado por el citómetro, los datos obtenidos son almacenados en la memoria del ordenador y desde allí pasados a archivos

58

MATERIAL Y MÉTODOS

binarios que luego serán analizados por el software.

2.2.5.1 Viabilidad espermática

Para el estudio de viabilidad espermática se realizó la siguiente solución de trabajo. En 20ml de solución salina Cell Wash se añadieron 48µl de una solución de ioduro de propidio 2,4mM en agua destilada, y 8µl de una solución SYBR-14 100µM en DMSO. De esa solución se repartieron 500µl a los tubos de citómetro, uno por cada una de las muestras a analizar. Posteriormente se añadió 0,4µl de muestra a cada tubo de citómetro. Las muestras fueron incubadas durante 15 minutos en baño seco a 37ºC antes de ser analizadas en el citómetro de flujo. Se midió la fluorescencia de 10000 espermatozoides, usando el filtro 560 SP para detectar la fluorescencia del SYBR en el detector FL1, y un filtro 640 LP para detectar la fluorescencia del IP en el detector FL2. Los parámetros de análisis del citómetro fueron establecidos antes del análisis de las muestras. Una vez leída la primera muestra y ajustadas las regiones del citograma, éstas permanecieron invariables durante el resto de la lectura.

2.2.5.2 Resistencia térmica

El análisis de termorresistencia se realizó siguiendo el mismo procedimiento que el análisis de viabilidad espermática a los 0, 60 y 120 minutos de incubación en baño seco a 37ºC.

2.2.5.3 Fragmentación de la cromatina

Para el estudio de la fragmentación de la cromatina se emplearon las mismas muestras que en los casos anteriores. El protocolo empleado fue muy similar al seguido por autores previos (Evenson & Jost, 2000). Un total de 10µl de semen fue disuelto en 1ml de solución TNE buffer (0,015N NaCl, 0,01M Tris y 0,001M etilen-diamoni-tetra-acético (EDTA), pH=6,8) hasta alcanzar una concentración de 1 106 spz/ml. De esta solución se tomaron 200µl y se introdujeron en tubo de citómetro, posteriormente se añadió 400µl de solución ácida (0,08N HCl, 0,1% triton-X 100, 0.15M NaCl, pH=1,2) durante treinta segundos exactamente, tiempo que se considera suficiente para que perfore la membrana plasmática, provoque la desnaturalización del ADN y permita el posterior paso del fluorocromo. A continuación se le añadió 1,2 ml de solución de

59

MATERIAL Y MÉTODOS

naranja de acridina [6µg/ml en buffer fosfato citrato (0,1M ácido cítrico, 0,2M Na2HPO4, 1mM EDTA, 0,15M NaCl)] que se une a la hebra de ADN, tanto a fragmentos simples como a fragmentos dobles. Antes de ser analizadas mediante citómetro de flujo, las muestras fueron incubadas a 37ºC durante 10 minutos para dar equilibrio a la naranja de acridina y permitir mayor estabilidad hidrodinámica en la muestra con los fluidos. Se midió la fluorescencia de 5000 espermatozoides, usando un filtro 560 SP para recoger los valores de fluorescencia verde en el detector FL1, y un filtro 670 LP para recoger los valores de fluorescencia roja en el detector FL3.

La lectura de las muestras se realizó con el software Cellquest. Una vez leídas, los datos de citometría fueron recuperados usando el software WinMDI mediante el cual se representaron los citogramas, colocando en el eje de las abscisas la fluorescencia roja y en el eje de las ordenadas los valores de fluorescencia verde. Después de la eliminación del debris los datos se guardaron en formato texto. Posteriormente mediante la ayuda de la hoja de cálculo Excel, se creó la variable αt, como resultado del cociente de la fluorescencia roja y la fluorescencia total (verde más roja). La nueva variable fue representada mediante un histograma con la ayuda del programa estadístico SPSS, donde se calcularon los valores de referencia de la variable αt (SDαt, Xαt, COMPαt). Los parámetros de

análisis del citómetro fueron establecidos antes del análisis de las muestras, y antes del análisis de cada grupo de dosis se procesó una muestra de referencia para asegurar que los valores medios de fluorescencia roja y verde permanecían constantes. La población principal de está muestra de referencia se situó entre los 400 canales de fluorescencia en el eje de las ordenadas y los 150 canales de fluorescencia en el eje de las abscisas.

2.2.5.4 Reacción acrosómica

Para el estudio de la reacción acrosómica se realizó previamente la siguiente solución de trabajo para el análisis en el citómetro de flujo: En 15ml de solución salina Cell Wash (Becton Dickinson) se añadieron 36µl de solución de ioduro de propidio 2,4mM en agua destilada, 6µl de solución SYBR-14 100µM en DMSO y 37.5µl de PNA 1mg/ml. De esta solución de trabajo se repartieron 500µl a los tubos de citómetro, uno por cada una de las muestras a analizar. Asimismo también fue necesaria la preparación previa de las siguientes soluciones:

60

MATERIAL Y MÉTODOS

-Talp-semen (10M NaCl, 3,1M KCl, 0,4µM MgCl2, 0,25µM NaH2PO4, 25µM

NaHCO3, 2µM CaCl2, 0,03µM Rojo Fenol, 16,5µM ácido láctico, 10µM Hepes)

-Talp stock (1,14M NaCl, 3,23M KCl, 0,5µM MgCl2, 0,3µM NaH2PO4, 25µM

NaHCO3, 2µM CaCl2, 0,03µM Rojo Fenol, 7,65µM ácido láctico)

-FIV (10ml Talp-Stock, 6 mg/ml BSA, 0,4µM Piruvato, 0,25µg/ml Gentamicina) -Sol 10x (1M KCl, 0,1M NaH2PO4, 0,8M NaCl, 0,1M Hepes)

-Percoll 45 (300µl Percoll 90, 300µl Talp-Semen)

-Percoll 90 (0,9 ml Percoll 90% 1,130g/cm3, 100µl sol 10X, 2mM CaCl2, 0,4mM

MgCl2, 0,02mM ac. láctico, 0,025mM NaCO3)

Posteriormente, en eppendorfs de 1,5ml y por cada una de las dosis a analizar se prepararon los gradientes de densidades o soluciones Percoll. Para ello se colocaron primeramente 400 µl de solución Percoll 45 en el tubo eppendorf. Seguidamente se depositaron en el fondo del mismo tubo 400 µl de solución Percoll 90, de manera que la solución Percoll permaneció con la solución Percoll 90 en la parte inferior del tubo eppendorf, y con la solución Percoll 45 en la parte superior. Además de las soluciones Percoll se prepararon también eppendorfs de 1,5ml con 400µl de solución FIV, uno por cada dosis de semen a analizar.

Una vez preparadas todas las soluciones necesarias para el análisis, se depositaron con cuidado 130µl de cada dosis seminal en la superficie de las soluciones Percoll, de manera que en la parte inferior del eppendorf se encontraba la solución Percoll 90, en el medio la solución Percoll 45 y el semen en la parte superior. Posteriormente se centrifugaron los eppendorfs a 12000 r.p.m. durante 5 minutos de forma que después de la centrifugación el semen móvil se depositó en el final del eppendorf, separándose así del diluyente de congelación y del resto del semen muerto e inmóvil (Figura 13). Después de la centrifugación se recuperaron 50µl de semen del sedimento y se introdujeron en eppendorf con la solución FIV. De esta nueva solución (FIV+ semen) se extrajeron 150µl que se depositaron en un nuevo eppendorf y que actuó como control, y otros 150µl que se depositaron en otro eppendorf y a los que se le añadió 0,375 µl de solución de ionóforo de calcio (2mM en DMSO). De esta forma por cada dosis analizada se obtuvieron 2 muestras, una que no se sometió a la acción del ionóforo de calcio, que actuó como control de la reacción acrosómica, y otra cuya racción acrosómica se produjo artificialmente mediante el

61

MATERIAL Y MÉTODOS

ionóforo de calcio. Las muestras fueron incubadas durante 40 min en baño seco a 37ºC.

Para su posterior análisis en el citómetro se introdujeron 20µl de cada muestra anterior en los tubos de citómetro que contenían 500µl de solución SYBR-IP-PNA y se dejaron incubar a 37ºC durante 15min. Se midió la fluorescencia de 5000 espermatozoides, usando un filtro 560 SP para detectar la fluorescencia del SYBR en el detector FL1, y un filtro 640 LP para detectar la fluorescencia del IP en el detector FL2 y la fluorescencia del PNA en el detector FL4. Los parámetros de análisis del citómetro fueron establecidos antes del análisis de las muestras. Una vez leída la primera muestra y ajustados los cuadrantes del citograma, éstas permanecieron invariables durante el resto de la lectura.