3.11 2 Cálculo de los valores termodinámicos de la interacción de las proteínas TIM murinas por FS mediante SPR.
4.6. Análisis biofísico de la interacción de las proteínas TIM con FS en membranas.
4.6.2. Análisis espectroscópico de la interacción de las proteínas TIM con FS en liposomas.
Los dominios IgV de las proteínas TIM tienen un peso molecular de aproximadamente 16 kDay contiene, dos o tres residuos de Trp y tres o seis residuos de Tyr (Fig. 4.30A). Según muestran las estructuras, el residuo de Trp del lazo FG de mTIM- 1 y mTIM-4 o del lazo CC´ en el caso de mTIM-3, están expuestos al solvente e interaccionan con FS en los complejos cristalográficos. Experimentos de mutagénesis han mostrado que estos residuos aromáticos son esenciales para la interacción de las proteínas TIM con FS en liposomas (Fig. 4.22). Durante esta interacción es de esperar que los residuos aromáticos experimenten un cambio en su entorno, ya que pasarán de estar expuestos al medio polar del solvente a un entorno relativamente hidrofóbico de la membrana. Estos cambios en el entorno del residuo de Trp deberían provocar una variación en los espectros de emisión de fluorescencia de las proteínas, relacionado con su interacción con membranas (171). Para determinar la posible penetración en membranas del residuo de Trp del MILIBS de las proteínas TIM durante su unión a FS, procedimos a determinar los espectros de fluorescencia de estas proteínas en presencia y ausencia de liposomas de FS y FC.
En primer lugar determinamos los espectros de fluorescencia intrínseca de los dominios N-terminales de las proteínas TIM en solución y en ausencia de FS (Fig. 4.30B). Las proteínas TIM presentaron unos máximos de fluorescencia intrínseca de 353 nm en el caso de mTIM-1, 340 nm en el caso de mTIM-2, 350 nm para mTIM-3 y 345 nm en el caso de mTIM-4 (Fig. 4.30C). mTIM-2 tiene el máximo de emisión de onda a una longitud de onda menor, lo que debe indicar que los residuos de Trp se encuentran menos expuestos en esta proteína.
Una vez obtenidos los espectros de fluorescencia intrínseca de las proteínas TIM en solución, determinamos los espectros de fluorescencia de las proteínas TIM tras diferentes tiempos de incubación con liposomas de FS y FC. Al incubar las proteínas con liposomas Figura 4.30. Emisión de fluorescencia intrínseca de las proteínas TIM murinas. A. Representación de las estructuras de los dominios IgV de las diferentes proteínas TIM murinas, con los residuos de Tyr en rojo y los Trp en verde. B. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca a 290 nm y 275 nm de las proteínas mTIM-1 (rojo), mTIM-2 (naranja), mTIM-3 (verde) y, mTIM-4 (azul). C. Tabla donde se muestran el número de residuos de Tyr y Trp, así como la longitud de onda de emisión máxima a 290 nm de las diferentes proteínas TIM murinas.
W W W B A C !"#!$%&!! "#!$'%! !()*!+,-!.(! /.(0! ($1234! !" #" !$!" ($123+! %" #" !&'" ($1235! %" #" !$'" ($1236! !" !" !&$"
de FS, observamos una disminución de la intensidad de fluorescencia con el tiempo de aproximadamente un 20% en el caso de mTIM-1 y mTIM-4, y de un 15% en el caso de mTIM-3 (Fig. 4.31). Esta disminución no se observó con mTIM-2 al incubarla con liposomas de FS o FC. Por lo tanto, estos resultados indican cierta especificidad en la interacción de las proteínas mTIM-1, mTIM-3 y mTIM-4 con FS, ya que los residuos de Trp de estas proteínas sólo experimentaron un cambio de entorno cuando incubamos las proteínas mTIM-1, mTIM-3 y mTIM-4 con liposomas de FS.
A continuación estudiamos los espectros de fluorescencia de las proteínas TIM incubadas durante 60 minutos con concentraciones crecientes de liposomas de FS y FC (Fig. 4.32A). La asociación de las proteínas TIM con los liposomas de FS produjo una disminución de la intensidad de fluorescencia de magnitud similar a la observada anteriormente a diferentes tiempos de incubación cuando alcanzamos una relación molar 1:15 de proteína:lípido (Fig. 4.32B). Con mTIM-2 o al incubar las proteínas TIM con liposomas de FC, no se observó disminución en la intensidad de fluorescencia.
0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 0 20 40 60 80 100 120 F/Fo Tiiempo (minutos) mTIM-1 mTIM-2 mTIM-4 mTIM-3 FC B A
Figura 4.31. Variación de los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca con el tiempo de las proteínas TIM murinas en presencia de liposomas de FS y FC. A. Espectros de emisión de fluorescencia a 290 nm de las proteína mTIM-1 a 3 µM a diferentes tiempos de incubación, desde 0 a 120 minutos, en presencia de 40 µM liposomas de FS y FC. B. Cambio en la fluorescencia (F/F0) en función del tiempo para las diferentes proteínas
TIM murinas a 3 µM en presencia de 40 µM de liposomas de FS o FC. El cambio de fluorescencia relativa en presencia de liposomas de FC corresponde a la proteína mTIM-4.
Tras los resultados obtenidos con las proteínas salvajes, decidimos usar esta técnica para estudiar los mutantes del MILIBS, mutantes de residuos que están directamente implicados en la interacción con FS. Para ello, determinamos los espectros de fluorescencia intrínseca a 290 nm de los mutantes de mTIM-4 sin los residuos hidrofóbicos del lazo FG (mTIM-4 FW/AA) o sin los residuos de coordinación con el metal (mTIM-4 ND/AA). Mientras que la proteína mTIM-4 salvaje y el mutante mTIM-4 ND/AA presentan un máximo de intensidad de fluorescencia intrínseca a 345 nm, el mutante mTIM-4 FW/AA presenta su máximo de emisión de onda desplazado a longitudes de onda menores de 339 nm, máximo típico de un Trp interno al dominio (Fig. 4.33). Al mutar el residuo de Trp expuesto al solvente en el lazo FG, la emisión de fluorescencia intrínseca de la proteína mutante está generada exclusivamente por los otros dos residuos de Trp no expuestos al solvente.
Figura 4.33. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de mTIM-4 y los mutantes mTIM-4 ND/AA y FW/AA . Se muestran los espectros de emisión a 290 nm de fluorescencia intrínseca de las proteínas mTIM-4 (azul), el mutante de los residuos de coordinación del metal mTIM-4 ND/AA (cian) y el mutante que carece de los residuos hidrofóbicos de la zona superior del lazo FG mTIM-4 FW/A (magenta).
0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 1,10 1,15 0 5 10 15 20 25 30 F/Fo Lipido:proteina (µM) mTIM-1 mTIM-2 mTIM-4 mTIM-3 FC B A
Figura 4.32. Variación de los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de las proteínas TIM murinas en presencia de concentraciones crecientes de liposomas de FS y FC. A. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca a 290 nm de la proteína mTIM-1 a 3 µM con concentraciones crecientes de liposomas de FS (izquierda) y FC (derecha). Espectros determinados sin liposomas (0µM) y tras 60 minutos de incubación con 1µM, 1.5µM, 3µM, 6µM, 12µM, 20µM y 30µM de liposomas. B. Cambio en la fluorescencia relativa en función de la relación lípido:proteína para las diferentes proteínas TIM murinas a 3 µM tras 60 minutos de incubación con liposomas de FS y FC. El cambio de fluorescencia relativa en presencia de liposomas de FC mostrado corresponde a la proteína mTIM- 4.
Los espectros de la proteína mTIM-4 salvaje y los mutantes en presencia de liposomas de FS, mostraron que la intensidad de fluorescencia de las dos proteínas mutantes no se ve disminuida de igual manera que la de la proteína salvaje. Mientras que la intensidad de fluorescencia de mTIM-4 disminuyó un 20% tras una hora de incubación con 10 µM de liposomas de FS, la fluorescencia del mutante de los residuos de coordinación con metal mTIM-4 ND/AA disminuyó un 10%, mientras que no se observó disminución con el mutante mTIM-4 FW/AA (Fig. 4.34A). Obtuvimos resultados similares al incubar las proteínas con concentraciones crecientes de liposomas de FS durante una hora. Mientras que con la proteína mTIM-4 sí observamos una disminución
Figura 4.34. Variación de los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de mTIM-4 y los mutantes mTIM-4 ND/AA y FW/AA en presencia de liposomas de FS. A. Variación de la fluorescencia relativa en función del tiempo de mTIM-4 y los mutantes mTIM-4ND/AA y FW/AA a 3 µM en presencia de 40 µΜ de liposomas de FS. B. Espectros de emisión de fluorescencia intrínseca a 290 nm de las proteínas mTIM-4 (izquierda), mTIM-4 FW/AA (centro) y mTIM-4 ND/AA (derecha) a 3 µΜ tras 60 minutos de incubación con concentraciones crecientes de liposomas de FS. C. Variación de la fluorescencia relativa de las proteínas a 3 µΜ en función de la relación lípido:Proteína tras 60 minutos de incubación con liposomas de FS.
0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 0 5 10 15 20 25 30 F/Fo Lipido:proteina (µM) mTIM-4 mTIM-4 FW mTIM-4ND A C 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 0 20 40 60 80 100 F/Fo Tiempo (minutos) 0,70 0,75 0,80 0,85 0,90 0,95 1,00 1,05 0 1 2 3 4 5 6 7 8 F/Fo
Lipid/protein ratio (uM)
mTIM-4 mTIM-4 FW mTIM-4ND
de la intensidad de fluorescencia, no se observó disminución cuando realizamos el ensayo con los mutantes (Fig. 4.34B y C). Así mismo, al incubar la proteína salvaje y los mutantes con liposomas de FC a diferentes tiempos de incubación o a concentraciones crecientes de liposomas, no observamos disminución de la intensidad de fluorescencia (no mostrado).
Para estudiar el papel fundamental que desempeña el calcio en la interacción de las proteínas TIM con FS, determinamos los espectros de fluorescencia de mTIM-4 a 290 nm en ausencia de calcio. Los espectros de fluorescencia de mTIM-4 en presencia de liposomas de FS y en ausencia de calcio no mostraron una disminución de la intensidad de fluorescencia, sino un desplazamiento del máximo de emisión de onda hacía longitudes de onda menores (Fig. 4.35). El máximo de emisión se desplazó de 341 nm a 337 nm tras la adición de concentraciones crecientes de liposomas de FS. Una vez determinado el espectro de mTIM-4 con liposomas de FS en ausencia de calcio, se añadió calcio a la mezcla de incubación y se determinó un nuevo espectro. Tras la adición de calcio observamos una nueva variación en el espectro, la disminución de la intensidad de fluorescencia y el desplazamiento del máximo de longitud de onda hacia longitudes de onda mayores (Fig. 4.35A). No observamos este comportamiento cuando realizamos el mismo tipo de experimentos con liposomas de FC (Fig. 4.35B).
Figura 4.35. Efecto del calcio sobre los espectros de emisión de fluorescencia intrínseca de mTIM-4 en presencia de liposomas de FS (izquierda) o de FC (derecha). Espectros determinados en ausencia de calcio (rojo), tras la adición de 10 µM de liposomas (naranja) y tras la adición de 2,5 mM de calcio (azul). En el recuadro interno se muestra la variación del máximo de longitud de emisión con la relación lípido/proteína, en ausencia (rojo) y presencia de 2,5 mM de calcio (azul).