Análisis Estadístico.

Los análisis estadísticos los realizamos con el programa GraphPad Prism versión 5.0 para Windows (GraphPad software, San Diego, CA). Expresamos todos los datos como la media  SEM. El análisis estadístico que utilizamos dependió de cada condición experimental. Utilizamos un Test.t cuando comparamos dos grupos. Utilizamos un test de ANOVA de una vía para comparar varios grupos respecto al grupo control y un test de ANOVA de dos vías cuando hubo dos grupos experimentales sometidos a distintos tratamientos. En todos los casos utilizamos un Test de Newman Keuls como post-test para determinar si existían diferencias significativas entre grupos. Consideramos diferencias significativas cuando p≤0.05.

Materiales y Métodos

47 14. Nota

Sacrificamos a los animales de acuerdo a las normas internacionales aceptadas del “National Institutes of Health” (NIH). Todos los protocolos experimentales, que comprendieron el uso de animales, fueron aprobados por la Comisión de Bioterio del Instituto Multidisciplinario de Biología Celular (IMBICE), la cual actúa como comisión de bioética en la utilización de animales.

Resultados

48 1- Núcleos cerebrales que median los efectos de ghrelina

Con el objetivo de definir cuáles podrían ser los potenciales circuitos a través de los cuales ghrelina regula las neuronas CRF del NPV decidimos primero evaluar que núcleos cerebrales activa (a) y a que núcleos cerebrales puede acceder (b) la ghrelina administrada exógenamente. Para ello administramos la ghrelina en forma subcutánea, utilizando dos dosis diferentes, o en forma central.

a) Núcleos cerebrales que se activan en respuesta a la ghrelina exógena

Administramos subcutáneamente vehículo conteniendo o no ghrelina en una dosis baja o en una dosis alta (0,06 o 0,6 nmol/g de peso corporal; respectivamente). En otro grupo de ratones inyectamos vehículo conteniendo o no ghrelina (0,6 nmol/ratón) en el ventrículo lateral cerebral. Inicialmente, determinamos las concentraciones de ghrelina que se alcanzan en cada situación experimental. Sacrificamos por decapitación 4 animales de cada condición experimental a los 30 y 120 minutos post-tratamiento. En el grupo tratado con vehículo las concentraciones de ghrelina fueron 250±32 y 268±26 pg/ml luego de 30 a 120 minutos post-tratamiento, respectivamente. En ratones tratados subcutáneamente con la dosis baja de ghrelina los valores plasmáticos de ghrelina ascendieron a 584±76 pg/ml luego de 30 minutos post-tratamiento (p<0.05, comparado con el grupo tratado con vehículo) y retornaron a 301±23 pg/ml, 120 minutos post-tratamiento. En ratones tratados subcutáneamente con la dosis alta de ghrelina, los niveles plasmáticos de ghrelina fueron 4207±583 y 1030±154 pg/ml, luego de 30 a 120 minutos post-tratamiento, respectivamente (p<0.01 comparado con el grupo tratado con vehículo). En ratones inyectados en el ventrículo lateral con ghrelina, las concentraciones plasmáticas de ghrelina fueron 317±39 y 240±32 pg/ml, luego de 30 y 120 minutos post-tratamiento, respectivamente. En grupos independientes de ratones evaluamos el consumo de alimento a los 30, 60 y 120 minutos luego de la administración periférica o central de ghrelina. Para la administración periférica utilizamos un total de 37 ratones agrupados de la siguiente forma: 13 ratones inyectados con vehículo; 12 ratones inyectados con la dosis baja de ghrelina y 12 ratones inyectados con la dosis alta de ghrelina. Para la administración central utilizamos un total de 18 ratones; 5 ratones inyectados con

Resultados

49 vehículo y 13 ratones inyectados con ghrelina. Todos los grupos tratados con ghrelina tuvieron un aumento de la ingesta de alimento (Figura 4). No encontramos diferencias significativas en dichas variables en los grupos tratados periféricamente o centralmente con vehículo (p>0.09), por lo que agrupamos sus datos y los denominamos grupo vehículo. La administración periférica de ghrelina produjo un aumento de la ingesta de alimento dependiente de la dosis (3,2±0,7; 13,3±1,0 y 20,2±1,7 mg/g de peso corporal para vehículo, baja y alta dosis de ghrelina, respectivamente, p<0.05). La administración ICV de ghrelina estimuló la ingesta de alimento de igual forma que la administración subcutánea de la dosis alta de ghrelina (18,1±1,5 mg/g de peso molecular; p<0.05 vs grupo vehículo.

Para determinar los núcleos cerebrales que se activan en respuesta a ghrelina en cada condición experimental, anestesiamos a los ratones 120 minutos después del tratamiento, los perfundimos, obtuvimos los cerebros, los cortamos en secciones coronales y realizamos una IHQ contra el marcador de activación neuronal c-fos. Elegimos este tiempo en base a evidencias previas que muestran que la presencia de la proteína c-fos nuclear requiere no sólo de la expresión génica sino también de la biosíntesis y movilización de proteínas desde el citoplasma al núcleo de la célula [14]. En ratones tratados periféricamente con la dosis baja de ghrelina Figura 4. Consumo de alimento 120 minutos (min.) después de la administración subcutánea o ICV de vehículo conteniendo o no ghrelina en ratones alimentadosad libitum.Los datos representan la media SEM. a, p<0.05 vs. grupo vehículo. b, p<0.05 vs. grupo con dosis baja de ghrelina s.c. pc: peso corporal.

0 5 10 15 20 25 In g e s ta d e a li m e n to (m g /g pc ) 1 2 0 m in . p o s t- tr a ta m ie n to . a a,b a,b vehículo ghrelina, s.c 0,06 nmol/g pc ghrelina, i.c.v 0,6 nmol/ratón ghrelina, s.c 0,6 nmol/g pc

Resultados

50 observamos células inmuno-reactivas para c-fos exclusivamente en el ARC. En ratones tratados periféricamente con la dosis alta de ghrelina, observamos células inmuno-reactivas para c-fos en el ARC y en otras áreas del cerebro, tales como el NTS y el NPV. En ratones inyectados centralmente con ghrelina, observamos células inmuno-reactivas para c-fos no sólo en los núcleos mencionados anteriormente si no también en otras áreas cerebrales como el AHA, el DM y el VTA, entre otras (Tabla 2).

Tabla 2. Análisis cualitativo de c-fos1 en núcleos cerebrales de ratón.

Vehículo 0.06 nmol/g pc