Análisis de la expresión de ompQ a lo largo del cultivo en biofilm

El hecho de que OmpQ se vuelve relevante en el momento en el que el biofilm necesita consolidar su estructura (es decir, entre las 24 y 48 h), nos llevó a pensar si la expresión de la porina se encuentra alterada en esta etapa. Para estudiar esto, se analizó, utilizando qPCR, el nivel de expresión de ompQ en células de B. bronchiseptica RB50 crecidas en biofilm a las 24, 48 y 72 h de cultivo. Los niveles de expresión fueron comparados con aquellos encontrados en células planctónicas de la cepa RB50 recolectadas en fase exponencial de crecimiento. Mientras que las células de biofilm de 24 h mostraron un incremento menor de la expresión relativa de ompQ con respecto a células planctónicas creciendo exponencialmente, células de biofilms de 48 h mostraron niveles de expresión relativa de ompQ que fueron más de dos veces mayores que aquellos encontrados en la población planctónica (Figura 10). A su vez, la expresión de ompQ disminuyó significantemente en células de biofilm de 72 h. Debido a que los defectos de la cepa mutante B. bronchiseptica ΔompQ observados a las 48 h se extienden a lo largo del tiempo (al menos observado hasta 96 h), estos resultados sugieren que el claro incremento del nivel de ARNm de ompQ, y probablemente los niveles de proteína OmpQ, a las 48 h, sería necesario para promover el desarrollo y posiblemente el mantenimiento de un biofilm maduros.

Figura 10. Expresión relativa del gen ompQ a lo largo del proceso de formación de biofilm. El nivel de expresión relativa se determinó por medio de PCR cuantitativa en tiempo real en biofilms cultivados durante 24, 48 y 72 h (el nivel de expresión de ompQ en condición planctónica se indica como 1). ElmRNA 16 S fue utilizado como control de estandarización. La significancia estadística de los cambios en la expresión fue analizada por el Test de Student, los asteriscos * y ** indican un valor P < 0,05 y 0,01 respectivamente. Los datos se expresan como la media +/- SEM de al menos tres replicados biológicos y dos replicados técnicos. El nivel de cambio fue calculado utilizando el método ΔΔCt [9].

4.4.7. Expresión de OmpQ recombinante (OmpQr) y obtención de suero anti- OmpQr

Sobre la base de que OmpQ se muestra relevante para la maduración del biofilm de B. bronchiseptica, que es una proteína de membrana externa y que ha sido propuesta como un antígeno con generación de anticuerpos luego de una infección por B. pertussis [51, 52], nos propusimos analizar si anticuerpos contra OmpQ podrían tener algún efecto sobre la formación de biofilm. Para ello, se decidió obtener la porina de forma recombinante. De este modo, la secuencia codificante para el gen ompQ sin su secuencia señal de exportación, fue clonada en un plásmido para su expresión en la cepa E. coli BL21 Codon-Plus. La estrategia utilizada consistió en diseñar una construcción en la que una cola de 6 histidinas sea agregada a la secuencia aminoacídica de la proteína OmpQ, para luego facilitar la purificación de la misma. La inducción de la expresión de la proteína OmpQr se realizó durante 4h, luego del agregado del inductor IPTG al medio de cultivo. La expresión de la proteína recombinante se analizó por electroforesis en gel de poliacrilamida SDS-PAGE (Figura 11), observándose la sobreexpresión de la proteína de unos 40 kDa aproximadamente. La purificación de OmpQr se realizó por medio de una cromatografía de afinidad, utilizando una resina con cobalto, la cual se compleja con la cola de 6 histidinas presentes en OmpQr.

Luego de obtener la proteína recombinante, se la utilizó para generar anticuerpos in- Luego de obtener la proteína recombinante, se la utilizó para generar anticuerpos in-

50 kDa-

35kDa -

Figura 11. SDS-PAGE al 10%. Se muestra la inducción de la expresión de OmpQr en E. coli. Las bacterias fueron cultivadas hasta una DO600 de 0,4, la expresión de la proteína recombinante fue inducida durante 3 h al agregar IPTG 0,5 mM. Línea 1, marcador de peso molecular; línea 2, lisado celular sin inducir; línea 3, lisado celular luego de la inducción. La flecha indica la presencia de OmpQr.

1 2 3

Luego de obtener la proteína recombinante, se la utilizó para generar anticuerpos en ratones. Para ello, se inmunizaron ratones BALB/c con OmpQr formulada en adjuvante de Freund completo (primera inmunización) o con Freund incompleto (inmunizaciones subsiguientes). Se recolectaron muestras de suero al momento de cada inmunización y luego de 15 días de la última inmunización. Los títulos para los anticuerpos específicos obtenidos fueron determinados por ELISA (Figura 12.A). Adicionalmente, el suero fue evaluado para el reconocimiento de OmpQ por medio de Western Blot. Como se muestra en la Figura 12.B, en un lisado de células de B. bronchiseptica RB50 fue detectada por el suero una única banda del mismo tamaño de OmpQr lo que demostró su especificidad. El suero mostró a su vez reactividad en la muestra de OmpQr en bandas de diferente peso molecular. Esto puede ser el resultado de una reacción cruzada con proteínas inespecíficas del lisado post-inducción de E. coli o bien OmpQr degradada que se encontraban presentes en la muestra de proteína purificada. Sin embargo, el suero mostró una reactividad específica hacia una única proteína en el lisado celular de B. bronchiseptica.

A B

Figura 12. Reconocimiento de OmpQr por sueros de ratones inmunizados. A. El título de sueros de ratones inmunizados con OmpQr fue determinado mediante ensayos de ELISA en placas sensibilizadas con células enteras de B. pertussis o bien con OmpQr. Los resultados muestran la media ± DE. B. Cinco µg de muestras de lisado total de RB50 (línea 1) y OmpQr purificada (línea 2) se corrieron en electroforesis de poliacrilamida SDS-PAGE (12%) y fueron transferidos a una membrana de PVDF. El análisis por inmunoblot se realizó con el suero policlonal de ratón obtenido contra OmpQr, y con anticuerpos de cabra anti-IgG de ratón conjugados con fosfatasa alcalina.

50 kDa - 35 kDa -