V. MATERIAL Y MÉTODOS 34
VI.11. Estudio de vida de anaquel 65
VI.11.2. Análisis microbiológicos 69
VI.11.2.1. Coliformes totales.
Una de las contaminaciones más estudiadas y menos deseadas en alimentos debido a sus efectos, es la contaminación por coliformes. El grupo de bacterias coliformes agrupa a todas las bacterias entéricas que se caracterizan por tener las siguientes propiedades bioquímicas: ser aerobias o anaerobias facultativas; ser bacilos Gram negativos; ser oxidasa negativos no ser esporógenas; fermentar la lactosa a 35 °C en 48 horas, produciendo ácido láctico y gas (Walstra, 2001). Las bacterias de este género se encuentran principalmente en el intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, lo que significa una contaminación por heces en alimentos, además de generar defectos de sabor debido a su metabolismo putrefactivo (Waltras, 2001).
Se cuantificó haciendo una cuenta estándar con agar VRB sembrando en una dilución de 10‐3. Se obtuvieron resultados negativos (Tabla 16) para ambas formulaciones con probióticos en un lapso
de 20días, aunque, se tiene reportado que, si hay una presencia de coliformes, patógenos o no patógenos, en productos fermentados, hay una baja en la cuenta microbiana de coliformes, debido a la acidez y la presencia de bacteriocinas y otros antimicrobianos producidos por microorganismos probióticos (Kailasapathy, 2000).
Tabla 16. Cuenta estándar de UFC de coliformes totales durante un estudio de vida útil de 20 días para formulaciones de lactosuero fermentado con L. acidophilus con 20% de mango y B. bifidum con 15% de concentrado de mango. Día UFC/mL en formulación con L. acidophilus UFC/mL en formulación con B. bifidum 0 0 0 5 0 0 10 0 0 15 0 0 20 0 0
VI.11.2.2. Mesófilos aerobios.
Se realizó una cuenta de mesófilos aerobios para las formulaciones de lactosuero fermentado con concentrados de fruta, obteniendo resultados superiores a 1 x 105UFC/mL para ambas formulaciones. Esto era de esperar y así se estipula en las normas mexicanas, ya que, como producto fermentado con microorganismos probióticos, debe de tener una concentración > 1 x 108 UFC/mL.
Tabla 17. Cuenta estándar de UFC de mesófilos aerobios durante un estudio de vida útil de 20 días para formulaciones de lactosuero fermentado con L. acidophilus con 20% de mango y B. bifidum con 15% de concentrado de mango. Día UFC/mL en formulación con L. acidophilus UFC/mL en formulación con B. bifidum 0 > 10000 > 10000 5 > 10000 > 10000 10 > 10000 > 10000 15 > 10000 > 10000 20 > 10000 > 10000
VI.11.2.3. Cuenta viable de microorganismos probióticos.
Se realizó una cuenta de células viables de microorganismos probióticos en agar MRS, obteniendo resultados sin diferencia significativa (p>0.01) en el crecimiento de las cepas probióticas en el suero adicionado con concentrado de fruta.
Para la formulación con L. acidophilus, se inició con una cuenta microbiana de 1.05 x 108 UFC/mL,
obteniendo un crecimiento exponencial durante los primeros 10 días, llegando a una cuenta máxima de 7.02 x 108 UFC/mL. En la lectura del día 15 y 20, la cuenta microbiana bajó considerablemente pero se mantuvo en un conteo superior a 1 x 108 UFC/mL, obteniendo 3.92 x 108 UFC/mL.
En la formulación con B. bifidum, la cuenta de células viables inicial fue ligeramente mayor, de
2.00 x 108 UFC/mL, presentando un crecimiento exponencial durante los 10días consecutivos, obteniendo una cuenta máxima de 6.85 x 108 UFC/mL en el día 15. En la cuenta del día 20, hubo una baja de células viables, aunque se siguió manteniendo superior a 1 x 108 UFC/mL, obteniendo un valor de 5.8 x 108 UFC/mL.
En ambas bacterias se observa una disminución en cuenta viable de células al momento del inicio, ya que en el apartado VI.III. II., se observaba una cuenta viable superior a 7 x 108UFC/mL de cada una de las bacterias en el lactosuero de cabra fermentado. Esto es debido a que las bacterias sufrieron de estrés al momento del procesado, en donde el mezclado con los concentrados de fruta y el cambio de condiciones de pH, acidez, sustrato y exposición al oxígeno disminuyó la cuenta microbiana. En la literatura se hace hincapié en este hecho, ya que la baja de pH y la presencia de ácidos orgánicos son un punto crucial en la sobrevivencia de los microorganismos probióticos (Kailasapathy, 2000), además de que el estado fisiológico en el que se encuentre la bacteria la hace más susceptible a estas condiciones, reportándose que las bacterias en fase logarítmica son mucho más susceptibles a los cambios del medio que las bacterias en fase estacionaria (Heller, 2001). Otro punto importante en la viabilidad de los probióticos es el oxígeno disuelto en la formulación, ya que al momento del mezclado con otros ingredientes, como mermeladas, harinas de cereal o concentrados de fruta, así como el tipo de envase, puede incrementar la cantidad de oxígeno disuelto. Se ha observado que el oxígeno disuelto y la acidez en productos lácteos fermentados es mayor en los envasados en películas plásticas que los envasados en vidrio (Sha, 1995).
Fig. 25. Cinéticas de crecimiento durante 20 días a 4°C + 2 para formulaciones de L. acidophilus con 20%
mango y B. bifidum con 15% de mango.
Comportamientos similares en la curva de crecimiento de los microorganismos probióticos se tienen reportados en lactosueros fermentados llevados a almacenamiento a 4ºC durante 28 días. Drgalic, 2005, observó que lactosuero reconstituido y adicionado con inulina, las cuentas microbianas de L. acidophilus se incrementan en los primeros 10 días, mostrando una baja de
células viables entre los 10 y 15días, que continúa gradualmente hasta los 28días, dónde la cuenta microbiana ya ha bajado de >1x108UFC/mL a <1x107UFC/mL.. El comportamiento de
B. bifidum en
las mismas condiciones fue distinto, ya que hubo un crecimiento en los primeros 10 días y la cuenta de células se mantuvo estable sin un cambio significativo hasta el fin del estudio, manteniéndose en concentraciones >1 x 108UFC/mL. Hernández‐Mendoza, 2007 observó en suero reconstituido adicionado con sacarosa un crecimiento similar, donde B. bifidum se mantuvo en
concentraciones > 1 x 108UFC/mL sin cambio significativo durante 30 días de almacenamiento en refrigeración.
Por lo tanto, con los resultados obtenidos en nuestra investigación y con lo reportado en literatura, se puede inferir que el crecimiento de B. bifidum se pudiera mantener
microbiológicamente estable alrededor de 10 días más, mientras que el crecimiento de L. acidophilus será inhibido y disminuirá su cuenta microbiana. 1.00E+08 2.00E+08 3.00E+08 4.00E+08 5.00E+08 6.00E+08 7.00E+08 8.00E+08 0 5 10 15 20 UFC/ m L Tiempo (Día) L. acidophilus B. bifidum
VI.11.3. Análisis sensorial.
VI.11.3.1. Prueba de aceptación para formulaciones finales de lactosuero fermentado con concentrado de fruta y edulcorante.
De los resultados obtenidos de la evaluación sensorial, se realizó una ANOVA para comparar las frecuencias de aceptación de nuestras formulaciones, así como un estudio de supervivencia mediante estadística paramétrica para estimar su función de supervivencia y función de riesgo. De la ANOVA se obtuvo una diferencia significativa (p<0.01) en la aceptación de la formulación de SLCsc con L. acidophilus con respecto a la que contenía B. bifidum, obteniendo una mayor
aceptación para la primera formulación durante el tiempo del estudio (Fig. 26).
Fig. 26. Frecuencias de aceptación en una prueba de preferencia para las formulaciones de lactosuero fermentado con L. acidophilus con 20% mango y lactosuero fermentado con B. bifidum con 15% de mango.
En estudios anteriores, se ha observado comportamiento similar al momento de comparar la aceptación de formulaciones de lactosuero fermentado con bifidobacterias y lactobacilos. Un ejemplo lo hecho por Drgalic, 2005, dónde comparó el perfil sensorial de tres sueros fermentados, uno con Lactobacillus acidophilus, uno con Lactobacillus casei y otro con Bifidobacterium bifidum,
dando a degustar a un panel los lactosueros fermentados a diferentes horas de fermentación como a diferentes tiempos de almacenamiento, obteniendo resultados positivos para los fermentados con lactobacilos, con un sabor y aroma más definido a lácteo, agradable al panel; mientras que las muestras de lactosuero fermentado con B. bifidum no fue del agrado de los
0 5 10 15 20 25 30 35 0 5 10 15 20 Fr ec ue nci a Tiempo (días) Sí (Lactobacillus acidophilus) No (Lactobacillus acidophilus) Sí (Bifidobacterium bifidum) No (Bifidobacterium bifidum)