Tabla 16-3 Porcentajes de inhibición de la hialuronidasa en los venenos de serpiente Bothrops Atrox y Naja Atra
Realizado por: Ariel Torres, 2018
Al analizar la tabla 16-3 se observa que los porcentajes de inhibición de la hialuronidasa del veneno de serpiente Naja Atra son mayores que los valores de la inhibición de la hialuronidasa en el veneno de serpiente Bothrops atrox. Una vez que el ácido hialurónico entra en contacto con la hialuronidasa desencadena una reacción en la que se produce N-acetilglucosamina y turbidez.
68 70 72 74 76 78 80 82 84 0 200 400 600 800 1000 1200 Por ce n taje s d e in h ib ic ió n
Concentraciones de los extractos
Porcentajes de inhibición de la
hialuronidasa
porcentajes
Concentraciones Bothrops atrox Naja Atra
1000 4,69 14,59 250 17,18 30,12 50 23,53 35,05 25 23,80 37,12 12,5 24,07 37,92 6,25 23,05 40,17
40
La diferencia en el porcentaje de inhibición se debe posiblemente a la variabilidad genética de las serpientes que incide en la cantidad de hialuronidasa presente en los venenos.
Gráfico 2-3 Curvas de los porcentajes de inhibición de la hialuronidasa de los venenos de serpiente Naja Naja Atra y Bothrops atrox.
Realizado por: Ariel Torres, 2018
En la figura 7-3, se puede apreciar la inhibición de la hialuronidasa en los venenos de serpiente siendo mayor la inhibición a más bajas concentraciones. En el veneno de cobra la mejor inhibición se presentó a la concentración de 6,25 ppm con un porcentaje de 40,17%. Mientras que a la concentración de 1000 ppm el porcentaje fue únicamente de 14,59%. Mientras, que en el veneno de Bothrops atrox la concentración de 12,5 ppm dio un mayor porcentaje de inhibición con 24.07%.
Al parecer a más bajas concentraciones los compuestos presentes en el extracto hidroalcohólico desempeñan una mejor función debido a que hay menos compuestos que obstruyan su movilidad. Tabla 17-3 Absorbancias de la inhibición de la hialuronidasa del veneno de cobra
Absorbancias de la inhibición del veneno de cobra
tiempo Concentraciones control 1000 250 50 25 12,5 6,25 0 0,026 0,025 0,02 0,019 0,019 0,019 0,019 30 0,027 0,025 0,021 0,02 0,019 0,019 0,019 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 0 500 1000 1500 Por ce n taje s d e i n h ib ic ió n
Concentraciones de los extractos
Porcentaje de inhibición por
especies
Bothrops atrox cobra naja naja
41 60 0,028 0,025 0,021 0,02 0,019 0,019 0,019 90 0,03 0,025 0,022 0,02 0,019 0,02 0,019 120 0,032 0,025 0,021 0,02 0,02 0,02 0,018 150 0,033 0,026 0,021 0,02 0,02 0,02 0,018 180 0,033 0,027 0,021 0,021 0,02 0,02 0,018 210 0,033 0,028 0,021 0,02 0,02 0,019 0,018 240 0,033 0,028 0,023 0,02 0,019 0,018 0,018 270 0,033 0,028 0,023 0,02 0,019 0,018 0,018 300 0,033 0,028 0,023 0,02 0,019 0,018 0,018
Realizado por: Ariel Torres, 2018
Gráfico 3-3 Regresión cuadrática de segundo orden de las absorbancias de la inhibición de la hialuronidasa de
Naja naja atra
Realizado por: Ariel Torres, 2018
La absorbancia de la hialuronidasa del veneno de cobra en el espectrofotómetro está asociada significativamente (P< 0.01) al tiempo de evaluación, por lo que el 97,73 % de absorbancia está determinado por el tiempo siendo una regresión de segundo orden, en donde por cada segundo
y = -3E-08x2+ 2E-05x + 0,021 R² = 0,9773 0,021 0,021 0,022 0,022 0,023 0,023 0 50 100 150 200 250 300 350 Ab so rb an cia Período de Evaluación
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que transcurre hasta los 200s, el incremento de la absorbancia es de 2E-05 y a partir de este periodo la absorbancia empieza a reducirse en 3E-08, esto posiblemente se deba a una terminación del sustrato de la enzima.
Tabla 18-3 Absorbancias de las inhibiciones de la hialuronidasa del veneno de Bohtrops atrox a diferentes concentraciones
Absorbancias con el veneno de Bothrops atrox tiempo Concentraciones control 1000 250 50 25 12,5 6,25 0 0,028 0,028 0,025 0,023 0,023 0,023 0,023 30 0,029 0,028 0,026 0,024 0,024 0,024 0,023 60 0,03 0,028 0,026 0,024 0,024 0,024 0,023 90 0,03 0,031 0,026 0,024 0,024 0,024 0,024 120 0,03 0,031 0,026 0,024 0,024 0,024 0,024 150 0,031 0,031 0,026 0,024 0,024 0,024 0,025 180 0,034 0,031 0,026 0,024 0,025 0,024 0,025 210 0,034 0,031 0,026 0,024 0,024 0,024 0,025 240 0,034 0,031 0,026 0,024 0,024 0,024 0,025 270 0,034 0,032 0,027 0,024 0,024 0,024 0,025 300 0,034 0,032 0,027 0,026 0,024 0,024 0,025
Realizado por: Ariel Torres, 2018
Gráfico 4-3 Regresión cuadrática de segundo de orden del veneno de las absorbancias de la hialuronidasa de
Bothrops atrox
Realizado por: Ariel Torres, 2018
La absorbancia de la hialuronidasa del veneno de Bothrops atrox en el espectrofotómetro está asociada significativamente (P< 0.01) al tiempo de evaluación, el 96,35 % de absorbancia está determinado por el tiempo a una regresión de segundo orden, en donde por cada segundo que
y = -2E-08x2+ 1E-05x + 0,0249 R² = 0,9635 0,025 0,025 0,026 0,026 0,027 0,027 0,028 0,028 0 50 100 150 200 250 300 350 Ab so rb an cia Período de Evaluación
43
transcurre hasta los 180s, el incremento de la absorbancia es de 1E-05 y a partir de este periodo la absorbancia empieza a reducirse en 2E-08.
De lo anteriormente mencionado, se puede decir que, a menor concentración de extracto hidroalcohólico, se libera menor cantidad de N-acetilglucosamina produciendo mayor porcentaje de inhibición. También a un tiempo de 180s, el sustrato se termina y por ende la reacción enzimática se estabiliza (Sánchez, 2015, p.50).
3.7 Análisis estadístico
Tabla 19-3 Análisis estadístico test de Fisher
F. Var. Gl S. Cuad. C. Medio Fisher P. Fisher
Total 153 0,0030 P. evaluac. 10 0,0001 0,0000 6,56 3,6E-08 Reptiles 1 0,0006 0,0006 569,55 2,4E-49 Concentración 6 0,0021 0,0003 306,84 3,4E-74 Inter. AB 6 0,0001 0,0000 13,19 1,3E-11 Error 130 0,0001 0,0000 CV % 4,3784 Media 0,0243
Realizado por: Ariel Torres, 2018
Los datos obtenidos se analizaron aplicando diferentes pruebas y tests estadisticos, para evaluar si existe o no diferencias significativas entre los diferentes extractos.
Se inició con el test de fisher, el cual indicó que se rechaza la hipótesis nula, por lo tanto los extractos hidralcohólicos de Piper peltatum inhiben la hialuronidasa debido a que la probabilidad de fisher es menor a 0,05.
Tabla 20-3 Evaluación de diferencias significativas Test de Tukey Reptiles Media Grupo
Cobra 0,02 a
Atrox 0,03 b
Realizado por: Ariel Torres, 2018
La absorbancia del veneno de cobra es de 0,02 valor que difiere significativamente del veneno del reptil B. atrox puesto que se registró una absorbancia de 0,03. Indicando que existe una mayor cantidad de inhibicion en la hialuronidasa del veneno de cobra.
44
Tabla 21-3 Diferencias significativas por concentraciones Test de Tukey Concentración Media Grupo
control 0,031 a 1000 0,028 b 250 0,024 c 50 0,022 d 25 0,022 d 12,5 0,022 d 6,25 0,021 e
Realizado por: Ariel Torres, 2018
La absorbancia de los venenos de los reptiles fue de 0,031 valor que difiere significativamente del resto puesto que al usar diferentes concentraciones de extracto hidroalcohólico de Piper peltatum a concentraciones de 1000, 250, 50, 12,5, 6,25 la absorbancia se redujo a 0,028 0,024 0,022 0,022 0,022 0,021 respectivamente. Esto se debe a que a menor concentración del extracto
Piper peltatum hay mayor efecto inhibitorio.
Tabla 22-3 Diferencias significativas de las concentraciones en función de todos los tiempos del análisis de los venenos de serpientes Test de Tukey
Inter. AB Media Grupo
A1B0 0,031 a A1B1 0,026 c A1B2 0,022 f A1B3 0,020 g A1B4 0,019 h A1B5 0,019 h A1B6 0,018 i A2B0 0,032 a A2B1 0,030 b A2B2 0,026 c A2B3 0,024 d A2B4 0,024 d A2B5 0,024 d A2B6 0,024 d
Realizado por: Ariel Torres, 2018
Al evaluar la absorbancia del veneno de cobra Naja naja y B. atrox sin el extracto, se registró absorbancias de 0,032 y 0,031 valores que difieren significativamente del resto de concentraciones puesto que la absorbancia va reduciendo en los 2 casos siendo mas evidente la
45
absorbancia al usar el extracto de Piper peltatum en el veneno de de cobra puesto que se redujo hasta 0,08 y esto se debe a la variabilidad de los venenos entre los generos Naja y Bothrops(De Roodt et al., 2005, p.19).
46 CONCLUSIONES
Mediante el tamizaje fitoquímico se identificó los compuestos existentes en el extracto de hojas de Piper peltatum los cuales fueron alcaloides, azúcares, flavonoides, fenoles, terpenos.
Se determinó la presencia de fenoles 14,49± 1,2 mg GAE/g de extracto de planta y flavonoides 14,53 ±0,208 mg de Quercetina/g de extracto seco de Piper peltatum, comparado a otras investigaciones bibliográficas se determinó que la cantidad de fenoles podría ser significativamente menor respecto a la especie que se ha investigado, mientras que en los flavonoides los valores se asemejan.
Se realizó el control de calidad de Piper peltatum mediante pruebas de Humedad, Cenizas Totales,Cenizas solubles en agua, y cenizas insolubles en ácido Clorhídrico, todos los valores obtenidos cumplieron con los límites establecidos por la USP #35, demostrando eficiente operatividad en el proceso de secado, conservación y el almacenamiento de la planta.
Se determinó la actividad inhibitoria de los extractos hidroalcohólicos de Piper peltatum,
sobre la enzima hialuronidasa bovina, su efecto disminuye significativamente a concentraciones mayores a 250 ppm, obteniendose un mayor efecto inhibitorio a la concentración de 250 ppm y a un tiempo de 180 seg.
Mediante el análisis estadístico, se demostró que la inhibición fue mayor con una media de un 28,07% en el veneno de cobra Naja Atra, difiriendo significativamente con el veneno de Bothrops atrox, donde se reportó una inhibición mucho menor de 14,96%. Esto puede darse por la variabilidad genética de las dos especies, y la cantidad de hialuronidasa presente en el veneno.
47 RECOMENDACIONES:
A la hora de efectuar el análisis enzimático es necesario tener un espacio limpio libre de impurezas que puedan afectar o alterar el análisis, de la misma manera los materiales deben estar bien limpios y secos debido a la sensibilidad de la enzima.
Es aconsejable realizar un estudio de la actividad con otros modelos experimentales in vivo.
Se recomienda realizar esta investigación con venenos de otras de serpientes debido a su uso tradicional en las mordeduras.
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ANEXOS
Anexo A. Preparación del tamizaje fitoquímico
Anexo B. Análisis de calidad del extracto Grafico 1A: Ensayo de cloruro férrico, resinas, y Borntrager.
Grafico 2A: Ensayo de alcaloides y baljet.
Grafico 1B: Analisis de sólidos totales disueltos
Anexo C: Inhibición de la hialuronidasa
Grafico 1C: Agregando la hialuronidasa Grafico 2C:Incubar a 37°C
Grafico 3C: colocando a agua hirviendo Grafico 4C: Reacción con p- dimetilbenzaldehido
Anexo E: Certificado de identificación de la especie vegetal