Unidad de Genómica del PTM/UCM.
9.1. Extracción de RNA
Las células de levadura se cultivaron en medio SR durante 18 horas y al cabo de este período se añadió nuevo medio de cultivo SR y galactosa a una concentración final del 2% hasta una D0600 de 0,3 para inducir la expresión de genes controlados por el promotor GAL1, y se incubaron a 30°C en agitación durante 4 horas. Se recogieron 5 ml de estos cultivos mediante centrifugación a 3000 rpm durante 3 minutos a 4°C y se extrajo el RNA mediante ruptura mecánica siguiendo las instrucciones del kit RNeasy MIDI kit (Qiagen). La concentración del RNA extraído se midió a 260 nm en un espectofotómetro ND-1000 (1 DO a 260 nm equivale a 40 μg/ml de RNA) y su calidad y perfil de tamaños se comprobó por cromatografía capilar en un cromatógrafo Bioanalyzer 2100B (Agilent Technologies). Para cada condición se extrajo el RNA de células de cultivos que procedían de tres transformantes distintos.
9.2. Síntesis, marcaje e hibridación de microarrays de DNA
El cDNA de doble cadena se sintetizó a partir de 5 µg del RNA extraído mediante transcripción reversa con el kit One-cycle cDNA Synthesis Kit (Affymetrix). Tras su
85 purificación con el kit GeneChip Sample Cleanup Module (Affymetrix), el cDNA se empleó como molde en la reacción de transcripción para generar el cRNA. Para ello se empleó el kit de marcaje GeneChip IVT Labeling Kit, el cual emplea análogos de nucleótidos marcados con biotina, que se incorporan al cRNA, de forma que éste queda finalmente marcado. A continuación el cRNA marcado con biotina se purificó empleando de nuevo el Sample Cleanup Module. Por último y con objeto de mejorar la sensibilidad en la posterior hibridación con el soporte, se hidrolizó el cRNA en fragmentos de 35 a 200 bases según las instrucciones del kit Sample Cleanup Module. La concentración y calidad del cRNA se midieron de nuevo en un espectrofotómetro y cromatógrafo, respectivamente. La hibridación se realizó sobre la plataforma Affymetrix, que contiene sondas que representan aproximadamente todos los ORFs de S.cerevisiae. El cRNA marcado y disuelto en un cóctel de hibridación, se incubó con el soporte conteniendo las sondas durante 16 horas a 45°C. Transcurridas las 16 horas de incubación, la plataforma se lavó en la estación de fluidos GeneChip Fluidics Station 450 y se tiñó con un conjugado fluorescente de Estreptavidina-Ficoeritrina, que se une a la biotina del cRNA marcado. Por último, la placa se escaneó y se registraron las señales de fluorescencia emitidas por la ficoeritrina.
9.3. Análisis de imágenes, procesamiento de datos y análisis estadístico
Los valores de intensidad de las señales de fluorescencia obtenidas se convirtieron en valores de expresión génica a través del programa GCRMA (Bioconductor) (Han et al., 2004). Para expresar las diferencias en los niveles de expresión se calculó un ratio que resultó de la media de las señales de fluorescencia de las muestras tratadas dividido entre la media de las señales de fluorescencia de las muestras control. Se consideraron inducidos por expresión de esta proteína aquellos ORFs cuyo ratio fue ≥1,7 y reprimidos aquellos cuyo ratio fue ≤0,6. El análisis estadístico se realizó con el programa Cyber-t (http://cybert.microarray.ics.uci.edu/) (Baldi y Long, 2001) que calculó un p-value Bayesiano para determinar la significación estadística de los ratios de inducción o represión. Sólo se tuvieron en cuenta para los análisis posteriores aquellos ORFs cuyos valores de señal presentaran un p value bayesiano ≤0,05.
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9.4. Análisis de resultados
Siguiendo estos criterios, los genes diferencialmente expresados con significación estadística se agruparon funcionalmente en categorías empleando las herramientas bioinformáticas Genecodis [http://genecodis.dacya.ucm.es, CNB-CSIC, Madrid; (Tabas- Madrid et al., 2012), (Nogales-Cadenas et al., 2009), (Carmona-Saez et al., 2007)], Go Term Finder y Go Slim Mapper [SGD (http://www.yeastgenome.org, Standford University, CA)]. Además, para determinar la significación estadística de la agrupación funcional se calculó un p value de Bonferroni para el porcentaje de genes relacionados con una función determinada en la lista de los diferencialmente expresados, con respecto al total de genes en el genoma relacionados con esa función. Para realizar la agrupación del perfil transcripcional obtenido en condiciones de expresión de p110α- CAAX con otros similares se empleó el programa MeV, seleccionando clustering jerárquico y medida de distancias euclidianas [(http://www.tm4.org/mev, Dana-Farber Cancer Institute, Boston) (Saeed et al., 2003; Saeed et al., 2006)].
Para determinar los factores de transcripción implicados en la regulación de los genes diferencialmente expresados se empleó de nuevo la herramienta Genecodis y para establecer un criterio de selección en el establecimiento de la asociación estadística se procedió al cálculo de un p value de Bonferroni de la misma forma que para el establecimiento de grupos funcionales. Se seleccionaron solo aquellos en los que este valor era ≤1·10-9.
9.5. RT-PCR cuantitativa en tiempo real
La RT-PCR cuantitativa se realizó por triplicado con los mismos RNAs que los empleados para microarrays de DNA. A partir de 2 µg de los RNAs se sintetizó por transcripción reversa el cDNA mediante el kit AS Transcription System (Promega). Las condiciones de la reacción de retrotranscripción fueron 45 minutos a 42°C, 5 minutos a 95°C y finalmente 5 minutos a 4°C. El cDNA se diluyó hasta 1:100 en agua MilliQ. En placas de 384 pocillos y por duplicado con cada cDNA obtenido, se añadieron 4,5 µl de cDNA, 5 μL de Power SYBR Green PCR Master MIX (Applied Biosystems) y 0,6 μL de la pareja de oligonucleótidos específicos a una concentración de 5 μM. Los oligonucleótidos fueron diseñados mediante el programa Primer Express y donados por el grupo del Dr. Arroyo
87 (Departamento de Microbiología II, UCM). Las secuencias para amplificar los genes se encuentran en la Tabla 6.
La PCR cuantitativa a tiempo real se realizó en Unidad de Genómica de la UCM en el equipo Applied Biosystems 7900HT Fast Real-Time. Las condiciones de reacción de PCR fueron un ciclo de 10 minutos a 95°C seguido de 40 ciclos de 15 minutos a 95°C y 1 minuto a 60°C. Para descartar la presencia de productos inespecíficos en la reacción, se realizó el análisis de curvas de disociación para cada uno de los genes amplificados. La expresión de los resultados obtenidos para cada gen se llevó a cabo normalizando los valores con respecto al gen control ACT1, cuya expresión se mantiene constante independientemente de las condiciones experimentales; los ratios de expresión diferencial se calcularon siguiendo el método 2-ΔΔCt descrito por Livak y Schmittgen (Livak y Schmittgen, 2001).