1.
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla I-1.- Densidad, viscosidad y difusividad de diferentes fluidos tipo __________________________________5 Tabla I-2.- Propiedades críticas de las sustancias más comúnmente empleadas en condiciones supercríticas _____6 Tabla I-3.- Solubilidad de ingredientes botánicos en CO supercrítico____________________________________82
Tabla I-4.- Ejemplos de antioxidantes dietéticos naturales cuya sinergia enzimática ha sido establecida ________17 Tabla I-5.- Composición de ácidos grasos de Spirulina platensis _______________________________________23 Tabla I-6.- Composición de vitaminas de Spirulina platensis, expresado en mg/kg _________________________24 Tabla I-7.- Composicion en aminoacidos en Dunaliella salina _________________________________________25 Tabla I-8.- Composición de aminoácidos de Chaetoceros muelleri (gracilis) en porcentaje en peso del total de aminoácidos ________________________________________________________________________________28 Tabla I-9.- Algunas páginas web de interés relacionadas con la SFE y las microalgas, así como sus aplicaciones industriales _________________________________________________________________________________31 Tabla II-1.- Actividad biológica de los principales tocoferoles. ________________________________________42 Tabla II-2.- Matriz del diseño experimental (compuesto rotativo de segundo orden con puntos de estrella) empleado en el presente trabajo de extracción supercrítica de Spirulina platensis. _________________________________47 Tabla II-3.- Distribución de pesos y rendimientos obtenidos en las extracciones realizadas empleando un 10% de etanol como modificador ______________________________________________________________________51 Tabla II-4.- Distribución de pesos y rendimientos obtenidos en las extracciones realizadas empleando únicamente CO . ______________________________________________________________________________________522
Tabla II-5.- Contenido de vitamina E (mg/g extracto) de los diversos extractos obtenidos en el separador 1 en las condiciones experimentales del diseño. ___________________________________________________________54 Tabla II-6.- Coeficientes de regresion, para los factores sin escalar, y valores estadísticos de su ajuste, obtenidos mediante MLR. ______________________________________________________________________________55 Tabla III-1.- Actividades antimicrobianas de los extractos supercríticos de Spirulina platensis. _______________71 Tabla III-2.- Distribución de ácidos grasos en los dos separadores de la extracción 1 ______________________72 Tabla III-3.- Valores de actividad antioxidante medida por el método de captura de radicales DPPH y expresada como EC50 en µg/mL _________________________________________________________________________74 Tabla III-4.- Actividad antioxidante medida por el método de autooxidación del ácido linoleico medida a dos concentraciones diferentes para cada fracción, expresada junto con la desviación típica. Extracciones con CO y etanol. _____________________________________________________________________________________752 Tabla III-5.- Actividad antioxidante medida por el método de autooxidación del ácido linoleico medida a dos concentraciones diferentes para cada fracción, expresada junto con la desviación típica. Extracciones con CO puro. ______________________________________________________________________________________762 Tabla III-6.- Identificación tentativa de las familias de compuestos extraídos de la microalga Spirulina platensis (condiciones experimento 1) correspondiente a los cromatogramas de la Fig. III-16. _______________________82 Tabla III-7.- Perfiles obtenidos por HPLC de los extractos realizados con CO y etanol_____________________832
Tabla III-8.- Perfiles obtenidos por HPLC de los extractos realizados con CO puro _______________________832 .
Tabla III-9.- Principales compuestos identificados con LC-MS y LC-MS/MS en las fracciones obtenidas en la extracción con fluidos supercríticos (220 atm y 55ºC) de Spirulina platensis ______________________________84 Tabla IV-1.- Diseño factorial empleado para la obtención de antioxidantes de Dunaliella salina. ____________100 Tabla IV-2.- Rendimientos y actividades antioxidantes obtenidos en los extractos SFE de Dunaliella salina ____101 Tabla IV-3.- Composición en carotenoides (expresada en mg de compuesto por 100 mg de extracto) de los extractos de CO de Dunaliella salina obtenidos en las condiciones de la Tabla IV-1. _____________________________1042
Tabla V-1.- Actividades antimicrobianas de los diferentes extractos de Dunaliella salina. __________________117 Tabla V-2.- Perfiles de ácidos grasos de los extractos de CO de Dunaliella salina medidos por GC-MS:
identificación, % área normalizada, y concentración _______________________________________________1182 Tabla V-3.- Identificación mediante GC-MS de los compuestos de la fracción volátil ______________________121 Tabla VI-1.- Condiciones experimentales empleadas para la obtención de extractos SFE de Chaetoceros muelleri130 Tabla VI-2.- Gradiente de fases móviles empleado para el análisis de lípidos en extractos de Chaetoceros muelleri
_________________________________________________________________________________________130 Tabla VI-3.- Rendimientos de extracción obtenidos en las extracciones con CO de Chaetoceros muelleri a las diferentes condiciones estudiadas ______________________________________________________________1322 Tabla VI-4.- Valores de actividad antimicrobiana de los diferentes extractos de Chaetoceros muelleri_________133
2.
ÍNDICE DE FIGURAS
Fig. I-1.- Diagrama de fases sólido/líquido/gas. PT: punto triple, PC: punto crítico, Pc: presión crítica, Tc: temperatura crítica____________________________________________________________________________ 5 Fig. I-2.- Variación de la densidad en función de la presión y temperatura en las cercanías del punto crítico. ____ 7 Fig. I-3.- Esquema básico de un extractor de fluidos supercríticos______________________________________ 10 Fig. I-4.- Distribución de las patentes sobre extracción supercrítica en Derwent Innovations Index en el periodo 1980-2006 _________________________________________________________________________________ 11 Fig. I-5.- Diferentes fotografías de Spirulina platensis vista al microscopio ______________________________ 21 Fig. I-6.- Clorofila a, la única descrita hasta la fecha en microalgas del phylum Cyanobacterium. ____________ 21 Fig. I-7.- Núcleo tetrapirrólico extendido de la ficocianina. ___________________________________________ 22 Fig. I-8.- Primeros dibujos de Dunaliella salina, realizados por Hamburger en 1905. ______________________ 24 Fig. I-9.- Diversas micrografías de Chaetoceros. ___________________________________________________ 27 Fig. II-1.- Estructura de los dos principales estereoisómeros del α-tocoferol._____________________________ 42 Fig. II-2.- Esquema de trabajo empleado para la optimación de la extracción ____________________________ 43 Fig. II-3.- Evolución de los componentes de la planta piloto de extracción con fluidos supercríticos con la que se ha realizado el presente trabajo y diagrama de flujo en el que se representa esquemáticamente el funcionamiento de dicha planta piloto. __________________________________________________________________________ 45 Fig. II-4.- Comparación de los datos para el equilibrio CO -etanol a diferentes temperaturas. _______________ 482
Fig. II-5.- Evolución del rendimiento frente al tiempo de extracción, condiciones de extracción_______________ 50 Fig. II-6.- Superficie de respuesta y diagrama de Pareto obtenido para el rendimiento en el separador 1 empleando CO y etanol________________________________________________________________________________ 522
Fig. II-7.- Superficie de respuesta y diagrama de Pareto obtenido para el rendimiento en el separador 1 empleando únicamente CO _____________________________________________________________________________ 532
Fig. II-8.- Diagramas de Pareto obtenidos para el el contenido en vitamina E de los diferentes extractos._______ 54 Fig. II-9.- Superficie de respuesta obtenida para la concentración de vitamina E empleando únicamente CO .___ 562
Fig. III-1.- Esquema de trabajo del proceso empleado para la caracterización químico funcional de los extractos SFE de Spirulina platensis. ____________________________________________________________________ 64 Fig. III-2.- 2,2-difenil-1-picrilhidrazilo (DPPH) ____________________________________________________ 66 Fig. III-3.- Ácido linoleico (arriba) y β-caroteno (abajo) _____________________________________________ 66 Fig. III-4.- Detectores de MS empleados en el presente trabajo: HP-1100-MSD de Agilent con interfase APCI y LCQ-DECA XP de Thermo-Fischer con interfase ESI _______________________________________________ 70 Fig. III-5.- Cromatógrafo de Gases empleado en el presente trabajo ____________________________________ 70 Fig. III-6.- Cromatogramas de la extracción 1 obtenidos por GC-FID, en la parte superior se puede ver la fracción correspondiente al separador 1 y en la inferior al separador 2 ________________________________________ 73 Fig. III-7.- Placa de TLC obtenida con la fase menos polar para los extractos 1 a 10. ______________________ 77 Fig. III-8.- Placa de TLC obtenida con la fase menos polar para los extractos 1 a 10 y revelada con DPPH. ____ 77 Fig. III-9.- Placa de TLC obtenida con la fase más polar para los extractos 1 a 10. ________________________ 77 Fig. III-10.- Placa de TLC obtenida con la fase más polar para los extractos 1 a 10 y revelada con DPPH______ 78 Fig. III-11.- Placa de TLC obtenida con la fase menos polar para los extractos 11 a 20 _____________________ 78 Fig. III-12.- Placa de TLC obtenida con la fase menos polar para los extractos 11 a 20 y revelada con DPPH. __ 78 Fig. III-13.- Placa de TLC obtenida con la fase más polar para los extractos 11 a 20_______________________ 79 Fig. III-14.- Placa de TLC obtenida con la fase más polar para los extractos 11 a 20 y revelada con DPPH ____ 79 Fig. III-15.- Espectros UV-Visible, de las principales familias de compuestos encontrados en los extractos de Spirulina platensis: carotenoides (A y B), clorofilas (C) y compuestos fenólicos (D). _______________________ 80 Fig. III-16.- Cromatogramas obtenidos en HPLC de la extracción 1.____________________________________ 81 Fig. III-17.- Cromatograma obtenido con LC-APCI-MS del experimento 2, separador 1.. ___________________ 85 Fig. III-18.- Espectro de MS obtenido en el minuto 17 en el experimento 2, separador 1 (sup.) junto con los espectros de MS/MS obtenidos al fragmentar los iones de 887,5 m/z (inf. izq.) y 1796,5 m/z (inf. dch.) _________________ 87 Fig. IV-1 .- Estructuras químicas de los principales carotenoides estudiados en el presente capítulo: α-caroteno, all- trans-β-caroteno, 15-cis-β-caroteno, 13-cis-β-caroteno y 9-cis-β-caroteno _______________________________ 95 Fig. IV-2.- Esquema de trabajo empleado para la optimación de la extracción ____________________________ 96 Fig. IV-3.- Reacción producida en el ensayo de actividad antioxidante empleado para medir la actividad de los extractos de Dunaliella. _______________________________________________________________________ 97 Fig. IV-4.- Equipo de extracción supercrítica de escala analítica Suprex-Prepmaster (Thar designs, Pittsburg USA) y esquema de funcionamiento __________________________________________________________________ 99 Fig. IV-5.- Diagrama de Pareto estandarizado y superficie de respuesta estimada para el rendimiento de extracción en función de la presión y la temperatura de extracción _____________________________________________ 102 Fig. IV-6.- Representación de los valores de rendimiento predichos por la Ecuación IV-2 y los valores reales observados ________________________________________________________________________________ 103 Fig. IV-7.- Cromatograma del extracto 7 adquirido a 450 nm (A) y zoom de la zona de isómeros del β-caroteno, minutos 21 a 27 (B). _________________________________________________________________________ 104
p. 150
Fig. IV-8.- Representación de los valores de TEAC pronosticados por la Ecuación IV-3 y los valores reales
observados ________________________________________________________________________________106 Fig. V-1.- Esquema de trabajo empleado para la obtención y caracterización antimicrobiana de los extractos de Dunaliella salina. ___________________________________________________________________________114 Fig. V-2.- Equipo de GC-MS empleado para el análisis de los extractos de Dunaliella salina________________115 Fig. V-3.- Representación de las actividades antimicrobianas de los extractos de Dunaliella salina) __________117 Fig. V-4.- Perfil GC-MS de ácidos grasos obtenido tras derivatización de la muestra 10 ___________________119 Fig. V-5.- Cromatograma de GC-MS de la fracción volátil del extracto 10 . _____________________________122 Fig. VI-1.- Esquema de trabajo empleado para la caracterización antimicrobiana de los extractos supercríticos de Chaetoceros muelleri.________________________________________________________________________128 Fig. VI-2.- Representación de los rendimientos obtenidos por orden decreciente de densidad de extracción ____132 Fig. VI-3.- Cromatograma obtenido con HPLC-ELSD del extracto de Chaetoceros muelleri obtenido (Exp. 3) __134 Fig. VI-4.- Composición en familias de lípidos de los extractos SFE de Chaetoceros muelleri y de un extracto líquido-líquido (L-L). ________________________________________________________________________135 Fig. VI-5.- Cromatograma GC-FID de extracto 3 tras derivatización. __________________________________135 Fig. VI-6.- Distribución de ácidos grasos en los extractos SFE y un extracto líquido-líquido (L-L) de Chaetoceros muelleri___________________________________________________________________________________136 Fig. VI-7.- Dendograma de las 26 variables estudiadas empleando el método de average linkage. ____________137