geles
Protocolo de extracción de Doyle y Doyle (1987) modificado
** Protocolo de extracción útil en A. squamosa y A. reticulata, a partir de material vegetal fresco macerado con NL2 (nitrógeno líquido).
Procedimiento:
Tomar una muestra de 500 mg de tejido fresco macerado con nitrógeno líquido. Utilice perlas de cristal si requiere. Precalentar en baño de maría (65°C) el buffer de extracción CTAB (previamente autoclavado). Buffer: CTAB 2%, NaCl
1.4M, β-mercaptoetanol 2%, EDTA 10 mM, TRIS:HCl pH 8.0 100 mM. Adicionar 800 µl de buffer de extracción CTAB.
Agregar β-mercaptoetanol (2%). Agitar en vórtex.
Incubar las muestras a 65°C en baño maría durante 45 minutos. Durante este tiempo, agite las muestras ocasionalmente y suavemente (aproximadamente 3 veces, cada 15 min).
Dejar enfriar a t° ambiente. Agregar 400 µl de SDS 20%. Agitar en vórtex.
Incubar las muestras a 65°C en baño maría durante 45 minutos. Durante este tiempo, agite las muestras ocasionalmente y suavemente (aproximadamente 3 veces, cada 15 min).
Dejar enfriar a t° ambiente.
Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 20 min. Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Adicionar al sobrenadante fenol (1:1). Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 20 min.
Adicionar al sobrenadante igual volumen de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 20 min.
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
Adicionar 2/3 volúmenes de isopropanol. Mezclar por inversión. Incubar over night (24 horas) a -20°C.
Periodo de precipitación:
Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min. Descartar el sobrenadante.
Adicionar 400 µl de ETOH 70%. Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Descartar el sobrenadante.
Adicionar 400 µl de ETOH 90%. Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Descartar el sobrenadante y dejar secar completamente el pellet. Hágalo en una cabina hasta que seque completamente.
Resuspender el ADN en 25 µl de la solución de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Adicionar 1 µl de RNAsa (10 mg/µl).
118 Evaluación morfológica de accesiones de anonáceas (anón, chirimoya y atemoya) en condiciones in situ, de las regiones Andina y Caribe Colombiano Protocolo de extracción de ADN de Escribano et al. (2004) y Fang et al. (1992), modificado
** Protocolo de extracción útil en A. cherimola, A. glabra, A. muricata, A. squamosa x A. cherimola y Rollinia sp, a partir de material vegetal fresco macerado con NL2 o material previamente almacenado (-20°C) macerado con NL2.
Procedimiento:
Tomar una muestra de material vegetal de 500 mg de tejido macerado con nitrógeno líquido. Utilice perlas de cristal si requiere.
Precalentar en baño de maría (65°C) el buffer de extracción CTAB (previamente autoclavado). Buffer de extracción: CTAB 2%, NaCl 1.4M, EDTA 0,02 M, Tris:HCl pH 8.0 0,1M, PVP 2%, bisulfito de sodio 1%.
Adicionar 800 µl de buffer de extracción CTAB. Adicionar 50 µl de Proteinasa K (20 mg/ml). Agregar β-mercaptoetanol (5%).
Agitar en vórtex.
Incubar las muestras a 65°C en baño maría durante 45 minutos. Durante este tiempo, agite las muestras ocasionalmente y suavemente (aproximadamente 3 veces, cada 15 min).
Dejar enfriar a t° ambiente.
Agregar 200 µl de SDS 20% y agitar en vórtex.
Incubar las muestras a 65°C en baño maría durante 45 minutos. Durante este tiempo, agite las muestras ocasionalmente y suavemente (aproximadamente 3 veces, cada 15 min).
Dejar enfriar a t° ambiente.
Adicionar 500 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min y transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
Adicionar 50 µl de CTAB 10% (previamente precalentado a 65°C en baño de maría). Mezclar por inversión. Incubar las muestras a 65°C en baño maría x 5 minutos y dejar enfriar a t° ambiente.
Adicionar 600 µl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1). Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo.
Adicionar 40 µl de Acetato de Na (3M), 100 µl de NaCl (5M) y 600 µl de isopropanol (frío). Mezclar por inversión cuidadosamente.
Incubar over night (48 horas) a -20°C. Periodo de precipitación:
Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min. Descartar el sobrenadante.
Adicionar 1000 µl de ETOH 70%. Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Descartar el sobrenadante.
Adicionar 1000 µl de ETOH 90%. Mezclar por inversión. Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Descartar el sobrenadante y dejar secar completamente el pellet. Hágalo en una cabina hasta que seque completamente.
Resuspender el ADN en 25 µl de la solución de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4). Adicionar 1 µl de RNAsa (10 mg/µl).
Incubar a 37°C por 15 min. Purificación:
Adicionar 100 µl NaCl (5M) y TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 7.4) hasta completar un volumen de 500 µl. Incubar a 65ºC por 5 min, para que pellet se resuspenda, si es necesario.
Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 10 min, para precipitar las impurezas (proteínas, polisacáridos, etc.) Transferir el sobrenadante a un tubo nuevo. Descartar el precipitado.
Adicionar al sobrenadante 400 µl de isopropanol (frío) y homogenizar cuidadosamente. Incubar a -20°C por 15min.
Agitar cuidadosamente y dejar nuevamente por 15 min (-20°C). Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min.
Descartar el isopropanol.
Lavar el pellet con etanol 70% (500 µl).
Centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 5 min. Repetir el lavado en más de una ocasión con etanol 70% y centrifugar nuevamente, si el pellet no se despeja de la base del tubo o aún está oscuro.
Lavar con etanol 100% (500 µl) y centrifugar a 14000 rpm (4°C) por 15 min. Descartar el sobrenadante y dejar secar completamente el pellet.
Resuspender el ADN en 25 µl de la solución de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8). Incubar a 37°C por 15 min.
Anexo 119
Principales resultados de la estandarización del protocolo de extracción de ADN (geles de
agarosa).
Obtención de ADN de material recién colectado de A. squamosa (ID A) con el protocolo de Doyle y Doyle (1987). Con el material previamente almacenado no se observan resultados favorables.
Nula efectividad de los protocolos Conejo (sin publicar), Saldaña y Salazar (2007) y Godoy y Jordano (2001) a partir de material maduro (almacenado por 6 meses a -20°C) de A. squamosa y A. reticulata.
Nula efectividad de los protocolos Escribano et al. (2004), Godoy y Jordano (2001) y Dellaporta (1983) a partir de material maduro (almacenado por 6 meses a -20°C) de A. squamosa y A. reticulata.
Parcial efectividad de los protocolos de Díaz et al. (2008), Hilje (2008) y Sharma et al. (2008), en accesiones de A.
squamosa (ID 117) y A. reticulata (ID 208).
Parcial efectividad del protocolo de Sharma et al. (2008), en accesiones de A. reticulata.
Protocolo de Doyle y Doyle (1987) con modificaciones en el buffer de extracción (CTAB 10%), el uso de un segundo buffer (CTAB 10%) y de fenol (1:1) junto con el CIA (24:1).
Alcalina (Sambrook y Russell, 2001)
114 Rol 250 A 116 208 170 216 202 275 178 150 175 B C 118 246 119 214 117 252
CTAB 2% (Doyle & Doyle, 1987) Jobes et al., 1995
C 161 172 210 232 117 170 210 232 246 150 161 170 175 M.P Protocolo EGGE Conejo (sin publicar) Protocolo BGP Mango (Saldaña y Salazar, 2007)
Protocolo Godoy & Jordano (2001) – V1 214 246 250 251 252 C 114 116 161 208 118 119 178 208 251 M.P Protocolo Escribano et al (04) Modif. Protocolo Godoy & Jordano (v2) Protocolo Dellaporta et al. (1983) Modificado 251 216 202 118 246 216 202 117 119 216 208 202 Protocolo Cactáceas Díaz et al., 08 Protocolo A. purpurea Hilje, 08 Protocolo Tuber crops Sharma et al., 08
Protocolo Tuber crops Sharma et al., 08
ID: A. reticulata 170 188 212 246
161 163 170 193 214 227 228 231 239 284 L50 L100
120 Evaluación morfológica de accesiones de anonáceas (anón, chirimoya y atemoya) en condiciones in situ, de las regiones Andina y Caribe Colombiano
Imágenes ejemplo de la visualización en geles de agarosa, de la extracción de ADN por
especie.
Con el protocolo de Jobes et al. (1995), se logra obtener ADN de A. glabra (ID 275) pero en una baja concentración. Ac (A. cherimola) y As x Ac (híbrido).
ADN de A. glabra (ID 275) y A. squamosa (material recién colectado, ID C)con el protocolo Doyle y Doyle (1990)
Efectividad del protocolo de Escribano et al. (2004), en accesiones de A. cherimola.
Efectividad del protocolo de Escribano et al. (2004), en accesiones de A. reticulata (ID 170 y 195) a partir de material maduro almacenado por 6 meses. Los resultados no son iguales en todos los materiales de esta especie.
ADN obtenido en A. squamosa (ID 236 y 250), A. reticulata (212) y Rollinia sp (Rol) con el protocolo de Escribano et al. (2004), a partir de material maduro almacenado por 6 meses.
114 116 117 118 119 150 161 172 175 178 250 214 250 251 275 170 208 210 232 246 252 202 216 Rol
A. squamosa A. glabra A. reticulata
As x Ac Ac Rollinia sp 172 202 216 252 275 C 202 253 255 257 258 259 261 263 250 213 116 114 Protocolo Escribano et al (2004) ID: A. cherimola Protocolo Hilje (2008) ID: A. squamosa 160 163 170 195 208 202 212 214 250 Rol 160 163 170 195 Protocolo Escribano et al (2004) As y Ar
Protocolo Tuber crops Sharma et al., 08 As, Ar y Rollinia 208 212 214 236 250 Rol Protocolo Escribano et al (2004) As, Ar y Rollinia