Angustia y fe

B. cinerea and R. stolonifer isolated from diseased strawberries were grown on PDA  (Potato Dextrose Agar) for 10‐14 days at 20 °C. After 10‐14 days growth, 5 mL of sterile  peptone water was pipetted onto the surface of the fungal colony and a sterile  spreader was used to mix fungal spores (conidia) into the peptone water, creating a  spore suspension. One mL of the spore suspension was then added to Microbank®  beads (Pro‐Lab Diagnostics, Austin, Texas, USA) and stored at ‐75 °C. When required,  one bead was removed and placed on PDA and incubated for 10‐14 days at 20 °C. Pure  cultures were prepared by transferring a small proportion of mycelium with the use of  a straight wire to PDA in Petri dishes, and incubated at 20 °C for 14 days. From these  two cultures 40 PDA coated Petri dishes were inoculated with the use of a straight  wire and incubated at 20 °C for 24 h to develop fungal colonies. In each case, after 

24 h, twenty (20) Petri dishes were kept at atmospheric pressure (101 kPaa) while the  other  20  were  subjected  to  50 kPaa  for  4 h.  All  Petri  dishes were subsequently  returned to 20 °C, with the mean radial growth was observed by measuring colony  diameter in two orthogonal directions using callipers. The experiment was completed  when the cultures reached the edges of Petri dishes. For B. cinerea, 8 measures were  conducted over 48 h, while for R. stolonifer, 10 measures were analysed over 12 h.  This experiment would help in understanding if there is any long‐term inhibition of  fungal germination due to short hypobaric treatment.  

For  spore  germination  study,  conidia  from  pure  cultures  were  harvested  by  suspending in sterile water containing 0.03% (v/v) Tween20. This conidial suspension  was then filtered through a sterile cheese cloth. The concentration of the filtrate was  adjusted with the help of haemocytometer to around 104 spores mL‐1 by adding sterile  water, 10 μL of this suspension was spread on each Petri slide and incubated at 20 °C  for 2 h (B. cinerea) and 5 h (R. stolonifer). In each case, after 1‐2 spores showed signs  of germination, twenty (20) Petri slides were kept at atmospheric pressure (101 kPaa),  whereas  the  other  20  were  subjected  to  50 kPaa  for  4 h.  All  Petri  slides  were  subsequently  incubated  at  20 °C.  Approximately  200  spores  per  replicate  were  counted for germination rate under microscope after 4 h of treatment. 

4.2.2 Oxygen treatment experiment

Field grown ‘Camarosa’ strawberries were obtained from a commercial grower in  Whanganui  region,  New  Zealand.  On  arrival  at  Massey  University,  bruised  and 

damaged fruit were removed from the population. Fruit with calyx and pedicel were  selected for experimental work. 

Fifty six clamshells (≈ 250 g each) of about 12–15 sound fruit were selected and were  divided into two treatments:  ≈ 10% O2 treatment for 4 h, or atmospheric conditions  (≈ 21% O2) for the same time at 20 °C. Strawberries in clamshells were kept in 7 L  airtight Perspex boxes (6 clamshells in each box) at 20 °C and exposed to 10% O2 (at  101 kPaa) or control (21% O2) by supplying the desired humidified gas mixture in a flow  through system. The 10% O2 treatment was achieved by reducing the oxygen content  of air through mixing with nitrogen (BOC, Auckland, New Zealand). The flow rate of  both treatments was maintained (0.5 L min‐1) for 4 h, to ensure no modification of the  gas environment due to strawberry respiration. 

For natural rot, 4 clamshells per treatment were assessed destructively on each  sampling day, with rot incidence determined by visually examining each berry. Fruit  with  visible decay  were counted and  the  results  recorded as percentage  of rot  incidence per clamshell. Observations of decay development were recorded daily.   

4.2.3 Inoculation of strawberry with B. cinerea and R. stolonifer

In a third experiment strawberries were inoculated with fungal spores in order to  investigate the possibility of induced resistance by hypobaric treatment. B. cinerea and  R. stolonifer were isolated from diseased strawberries, grown on PDA and incubated at  20 °C  until  conidia  developed.  Cultures  were  prepared  by  transferring  a  small  proportion of mycelia, with the use of a straight wire to PDA. After 7 days the conidia 

from each pure culture were harvested by suspending in sterile water containing  0.03% (v/v) Tween20. This conidial suspension was then filtered through a sterile  cheese cloth. The concentration of the filtrate was adjusted to approximately 104  spores mL‐1 with the addition of sterile water by estimating fungal spore concentration  through the use of a haemocytometer. 

Four hundred (400) hydroponically grown ‘Camarosa’ strawberries were obtained  from  Massey  University  Plant  Growth  Unit,  Palmerston  North,  New  Zealand.  Strawberries were disinfected by dipping in commercial grade NaClO solution (2%) for  5 seconds. After drying the fruit at room temperature, each fruit was placed in a  cylindrical plastic container (Figure 4.1) with a porous lid to avoid cross‐contamination  and ensure respiration. Half of the fruit were treated with hypobaric pressure (50 kPaa  for 4 h), with the others used as a control (101 kPaa). Each strawberry fruit from both  groups was inoculated by spreading 10 μL of spore suspension (104 mL‐1) of B. cinerea  or R. stolonifer on the surface 0, 6, 12, 18 or 24 h after hypobaric treatment.  

For each inoculation time, 20 individual strawberries were repeatedly assessed daily  for  rot  severity.  The  extent  of  macroscopic  fungal  development  of  individual  strawberry fruit was externally analysed by estimating the affected area percentage of  each fruit to nearest 10%. From these figures, mean percentage severity of infected  strawberry fruit was calculated. 

Figure  4.1  Each  strawberry  placed  in  a  separate  container  to  avoid  cross 

contamination.   

4.2.4 Hypobaric treatment and subsequent storage

Hypobaric pressure was generated in a hermetically sealed tank with a vacuum pump.  Clamshells/containers  of  strawberries  were  placed  inside  the  tank  at  20 °C  as  described in section 3.2.2. Samples were subsequently stored after pressure treatment  at 20 °C and 80–90% RH.