II. MARCO TEÓRICO CONCEPTUAL
2.3. Antecedentes empíricos de la investigación
a) Trên môi trường bổ sung đường nhiều lần; b) Trên môi trường chất béo.
1. Axit giberelic; 2. pH; 3. Sinh khối; 4. Lượng cacbon tiêu thụ; 5. Hàm lượng N trong môi trường.
Theo h ìn h 4.3, tro n g hai môi trường (saccarozơ và c h ấ t béo), k h o ả n g ngày thứ nãm lên men, nguồn nitơ cạn gần hết, sau đó axit giberelic được tổng hợp m ạ n h khi môi trư ờng thực t ế không có nitơ. Hệ sợi n ấm bị tự p h â n ở ngày th ứ 9 lên m en trê n môi trư ờng c h ất béo, sau đó sinh khối lại tă n g và lại giảm,... pH tro n g suốt quá trìn h là giảm, n h ư n g ở n h ữ n g ngày thứ 7 và thứ 11 pH đ an g giảm lại tăng, s a u đó tiếp tục giảm. Saccarozơ và c h ất béo trong môi trường ở giai đoạn đ ầu ( 3 - 7 ngày) hao đi k h á n h a n h để tă n g sin h khôi và tổng hợp một ít giberelin ỏ giai đoạn sau, nguồn cacbon hao đi chủ yếu để tạo t h à n h giberelin. 0 cuôì quá tr ìn h lên men, đường dư khoảng 3% và c h ấ t béo dư: 3,7%. T rên h ìn h 4.3 cho th ấ y n ấm n g ừng sử d ụ n g đưòng ở ngày thứ 17 và ngừng sử dụng c h ấ t béo ở ngày th ứ 1 1. Đường còn lại s a u khi lên m en chủ yêu ơ d ạ n g đưòng khử.
Hiệu s u ấ t sử dụng cacbon của chất béo để tổng hợp axit giberelic cao hơn 2,3 - 2,6 lần so với hiệu s u ấ t sử dụ n g cacbon của saccarozơ. H iêu s u ấ t lên m en nói c h u n g trôn môi trư ờng có c h ấ t béo cao hơn trê n môi trường đường. Nguyôn n h â n làm ức ch ế sinh
tổn£ h'Ợp của dường dư đã được đề cập ở phần trên. Ngoài việc không làm th a y đôi áp s u ấ t th ẩm th ấ u của môi trường, chất béo được biên đổi theo con trường p — oxy hóa, liên tục tách r a axit axetic — tiền chất đầu tiên của giberelin. Chính vì vậy m à các chất béo (dầu thực vật, mỡ cá voi) cũng n h ư axit béo cho hiệu s u ấ t lên m en giberelin cao.
Tổng hợp k ế t quả các công trình nghiên cứu trong lĩnh vực n à y th ấ y các chủng khác n h a u của giông F. m oniliform e có sự khác n h a u lớn về hoạt lực sinh tổng hợp giberelin (từ vài chục miligam đến gam hoặc cáo hơn trong 1 lít dịch nuôi cấy). Trong môi trường có nồng độ đường vừa phải thì amôn ta c tra t là nguồn nitơ tốt n h ấ t, còn khi sử dụng bột đậu tương cũng cho hiệu su ất tương đối cao n h ư n g pH đ ầu là 3,5. Các chủng F. m oniliform e cho hiệu s u ấ t cao trong quá trìn h lên m en dài ngày, được bổ sung nguồn cacbon để giữ nồng độ nguồn này luôn luôn trong k h o ả n g 1 - 4% và tổng sô" đường chi phí có thể quá 30%. Nguồn cacbon thích hợp cho lên m en dài ngày là các loại dầu thực vật, mỡ cá voi, axit palmitic và axit oleic. Nồng độ c h ấ t béo tốỉ thích là
8%. Trong trường hợp này, nguồn nitơ thích hợp là N H4N 03 (0,3%). D ùng c h ấ t béo làm nguồn cacbon bố sung vào môi trường một lần hoặc nhiều lần đều cho hiệu s u ấ t cao hơn troọg môi trường đường. Gibcrelin do nấm tạo th à n h được tích lũy trong dịch nuôi cay. Sau khi k ết th ú c lên men, dịch nuôi cấy được lọc để tá ch bỏ sinh khối hệ sợi và các tạp c h ất không tan. Dịch lọc đem dùng để tinh ch ế giberelin. Có ba phương p h áp tinh chế giberelin: phương p háp hấp phụ qua th a n hoạt tín h hoặc n h ự a trao đổi ion, phương pháp chiết x u ấ t b ằng dung môi và phương pháp k ế t tủ a từ du n g dịch.
Phương p h á p hấp p h ụ qua th a n hoạt tín h được các n h à k h o a học N h ậ t B ản dùng
sớm nhâ't và cũng là phương p háp cổ nhất. D ung dịch giberelin đã lọc bỏ các tạ p c h ất không ta n được điều chỉnh pH tới 3 - 3,5 để cho giberelin h ấ p p h ụ ở th a n h o ạ t tín h trong d ạ n g p h â n tử. Sau đó dùng các dung môi (axeton, cồn,...) đổ p h ả n h ấp phụ. Đôi khi còn dù n g am ôniac để kiềm hóa dung môi p h ả n hấp phụ. T rong sô" n h ữ n g dung môi dù n g vào mục đích n ày có dung dịch axeton 70% là th íc h hợp n h ấ t. Dịch p h ả n h ấp p h ụ chứa giberelin được lọc n h ữ ng tạp chất r ắ n rồi đem cô đặc, s a u đó c h iết xu ất bằng du n g dịch axctatety l. Dịch chiết x u ấ t cô đặc tiếp. T ro n g q uá tr ì n h cô, giberelin được kết tinh.
Phương pháp h ấp p h ụ trong k hoảng 15 n ă m gần đ ây được cải tiến b ằ n g cách th ay th a n hoạt tính b ằng n h ự a trao đổi ion để tách giberelin. Podojil và cộng tác (1961) dù n g nh ự a an io n it I RA - 400, n h ư n g quá tr ì n h h ấ p p h ụ và p h ả n h ấp p h ụ axit giberelic bị p há hủy một p h ần . M urom txev và cộng tác d ù n g n h ự a an io n it EDE - 10
trong d ạn g kiềm, sau đó d ù n g d u n g dịch n a tr i a x e ta t hoặc n a tr i clorua 0,3M để p h ả n h âp phụ. H iệu s u ấ t giberelin th u được cao hơn phương p h áp trên.
Có th ế dùng các d u n g môi n h ư cồn, axeton, các este phức tạ p để chiết x u ấ t giberelin từ dịch lọc sau k h i lên men. Các dung môi dù n g tro n g công việc n ày tương dôi thích hợp là m etylizobutylxeton, b u tanol và etylax etat.
Nhược điểm của phương p h á p n ày là phải dù n g n h iều d u n g môi. Phương pháp kêt tủ a axit giberelic từ d u n g dịch b ằ n g các ion s ắ t Fe2+hoặc F e ì+ tro n g môi trư ờng axit (pH 3 - 3,5). Các muối s ắ t thường dùng tro n g phương p h á p n à y là FeCl, và
beCl j. Kêt tủ a t h u được gồm phức hợp giberclin với s ắ t clorua và có th ể sử dụ n g trực ticp tro n g trồ n g trọ t hoặc dùng để tin h chế tiếp theo.
Trong trư òng hợp dù n g trực tiêp cho trồng trot, người ta sấy khô và n g h iề n nhỏ th u được ch ế p h ẩ m ỏ dạng bột có khoảng 1 0% giberelin. C h ế p h ẩ m này kh i sử dụng được xử lý bằng nước amôniac 0,5%, loại bỏ p h ầ n không ta n và t h u được dịch muôi amôn của giberelin.
Trong trường hợp th ứ hai kêt tú a ướt được hòa loãng b ằ n g nước am ôniac lọc bỏ p h ần không tan. Dịch lọc là muối amôn của giberelin được axit hóa tới pH 2 - 2 ,2 rồi chiết giberelin b ằ n g etyl axetat, sau đó cô dịch chiết tro n g ch ân không tới khi gibcrelin k ê t tinh. Theo M urom txev và cộng tác th ì phương p h á p này đơn giản, dễ thực hiện, không cần p h ả i dùng dung môi hữu cơ.
H àm lượng giberelin trong dịch nuôi cấy và tro n g c h ế p h ẩ m được xác đ ịnh bằng phương p h á p sín h học, phương p h á p so m à u hoặc p h ư ơ n g p h á p sắc ký. Phương p h áp sin h học d ự a trê n p h ả n ứng kéo dài các dóng cây non đem th ử . P h ư ơn g p háp so m à u dựa tr ê n m àu đặc trư n g của axit giberelic, tro n g du n g dịch có phức c h ất phosphovolfram m - molipden. Phương pháp sắc ký dựa trê n k h ả n ă n g dịch chuyển các c h ấ t giberelin trong các hệ thông dung môi h ữ u cơ k h ác n h a u tr ê n giấy, trê n bản mỏng hoặc cột. H iện các vết giberelin trê n sắc đồ bằng brôm - phenol xanh, A g N 03
p c cm an g an at, H9S 04 hoặc theo h u ỳ n h quang trong tia cực tím. Đe kiổm t r a các vết giberelin, người ta đem cắt các vết này trê n giấy, làm ướt hoặc hòa vào du n g dịch, sau đó đ ặ t các m ả n h giấy có vet hoặc dịch có vết hòa ta n vào gốc các cây non và tiến h à n h q u a n sát.
4.4. ỨNG DỤNG CỦA GIBERELIN
C h ế p h ẩm giberelin (kể cả ch ế phẩm thô th u được theo phương p h á p bề mặừ) được sử dụ n g vào sản x u ấ t thóc m alt (đại mạch nảy m ầm) từ n ă m 1940 ở N h ậ t Bản và được sử dụ n g rộng rãi vào trồng trọt sau n ăm 1960. W iltcr và Bukovac (1958)đã tiến h à n h nghiên cứu các m ặ t ả n h hưởng của giberelin đến sinh trư ơng của thực vật. Theo th ô n g báo của các tác giả này ta thấy, h ầ u n h ư giber.elin đều có ả n h hưởng đến t ấ t cả các loại thực vật, đặc biệt ở các p h ần p h á t triển m ạ n h hoặc ở các p h ầ n còn có th ể p h á t triển được ỏ cây. Sử dụng giberelin tương đổi đơn giản, có th ể d ù n g chúng ở d ạng bột nhão hoặc ở d ạn g dung dịch có nồng độ khác n h a u (từ 1 - l.oo o p p m /l hoặc cao hơn). Tác d ụ n g của giberelin đôn các loại cây th â n cỏ chỉ vài giờ sau là có thể th â y được, còn đối với n h ữ n g cây th â n gỗ phải sau vài tu ầ n .
Cần phải n h ấ n m ạ n h rằng, việc sử dụng giberelin p h ụ thuộc vào từ n g giông cây, loại cây, liều lượng sử dụng,... và sẽ cho kết quả dương hoặc k ế t q uả âm. Vì vậy, hiện nay giberelin mới được ứn g dụ n g vào trồng trọ t các loại cây n h ư nho, kho ai tây, c h an h cam, r a u ă n lá, ă n quả, cây cảnh trổ hoa và s ả n x u ấ t thóc malt; cồn các cây n h ư lúa, bông đ a n g th ử nghiệm , tác dụ n g âm r ấ t dễ th ấ y ỏ cây lúa. Cây lúa bị nhiễm giberelin hoặc bị n ấ m b ện h ký sinh sẽ trở th à n h lúa von, dóng dài ra, cây cao vọt lên, m àu sắc th a y đổi, không đ âm bông trổ h ạ t hoặc đâm bỗng n h ư n g k ế t h ạ t r ấ t kém.
tro n g nước ấrn (ba sôi h a i lạnh) đê giết các bào tử hoặc m â u sỢi nâm . Q u a n s a t các nấm bệnh của cây trồng th ấ y chúng sông ký sinh với bộ rê, p h á t tri ê n hệ sợi và mọc dài th eo các ông d ẫ n của rễ. ớ cây ngô, sợi n ấ m mọc d ài tro n g các ông d â n d à i tới 15 - 25cm. Trong quá tr ì n h sông, n ấ m tạo th à n h giberelin, a u x in và các c h ấ t có hoạt tín h sin h học khác. Các c h ấ t này n g ấm vào t ế bào cây q ua bộ rễ. G iberelin dù n g ở dạn g c h ế p h ẩm cũng được ngấm vào t ế bào và cũng gây r a các h iệ u ứn g giông như n ấm b ện h ký sin h với cây CÔI tạo th à n h . Song, dùng giberelin ta có th ể chọn đ ú n g đối tượng, dù n g với các nồng độ thích hợp và theo dõi các điều kiện th a o tác xử lý sẽ cho kết q uả dương.
Dưới ả n h hưởng của giberelin cho thấy, các t ế bào thực v ậ t và t ế bào p h â n cắt tã n g lên, sự biểu hiện tác dụ n g của c h ất này là làm th a y đổi h ìn h th á i cưa cây và h o ạ t tín h p h â n bào có tơ (mitoz). Giberelin có ả n h hưỏng tới n h iề u m ặ t tra o đổi chất tro n g q uá tr ì n h sông của thực vật: làm th ay đổi h à m lượng h y d r a t cacbon, h àm lượng các hợp c h ấ t nitơ, h o ạ t tín h của nhiều enzym, làm th a y đổi cường độ quang hợp. Song, đặc tín h và mức độ th a y đổi p h ụ thuộc vào liều lượng c h ế p h ẩ m được sử dụng, ’cũng n h ư điều k iệ n nuồi dưõng cây. Người ta đã xác đ ịn h được rằn g , các loại cây được xử lý giberelin đòi hỏi bón nhiều c h ất dinh dưởng hơn và c h ế độ tưới nước cần tă n g cường hơn.
Dưới ả n h hưởng của giberelin, các c h ất auxin được tạo t h à n h n h iề u hơn trong cây cối và nhờ sự đồng tác dụ n g của hai hợp c h ấ t này cho h iệ u q u ả kích th íc h sinh trương cao hơn. Trong trư ờng hợp n ày giberelin có th ể ức c h ế m ột sô" enzym gây m ất ho ạt tín h của auxin.
Giberelin kích thích m ạ n h sinh trưởng của cây chủ yếu ở th â n , cành, n h á n h , lá và với mức độ ít hơn ở rễ. S inh trư ởng ở th â n và cành cây được tă n g lên nhò kéo dài các dóng hoặc tă n g sô"lượng của chúng.
G iberelin ả n h hưởng không n h ữ n g đến sinh trương của cành, m à còn ả n h hưởng đên sự tạo t h à n h cành. Đôi với nhiều loại cây, trong một thời gian dài chỉ p h á t triển rễ chính, còn các c à n h c h ín h và cành phụ không được tạo th à n h . Dưới tác d ụ n g của giberelin, các cây n ày mọc cành n h á n h và p h á t triển r ấ t m ạn h . Đốì với n h ữ n g cây non thuộc giông cây h ai n ă m ở xứ lạ n h (cà rốt, bắp cải, củ cải đường, cải bẹ trắng,...) được xử lý b ằ n g giberelin sẽ r a hoa và k ết quả ô n ă m th ứ n h ấ t m à không cần phải qua giai đoạn x u â n hóa.
Giberelin thúc đẩy sự p h á t triể n của chanh, cam, đào, mơ và là m tă n g lượng quả của a n h đào, d â u tâ y cũng n h ư n h iều cây khác. Ta còn tìm th ấ y k ế t q uả r ấ t đáng khích lệ của giberelin tro n g trồ n g trọ t các loại cây công nghiệp: cây d ầu gai, chè, thuôc lá, nho và làm rụ n g đài ỏ cây bông. Giberelin d ù n g cho giông nho teo h ạ t, có thê cho tă n g n a n g s u â t t ru n g b ìn h 75%. Đôi với khoai tâ y được xử lý b ằ n g giberelin sẽ r ú t n g ắn thời gian tĩn h trước kh i n ảy mầm . G iberelin còn được d ù n g rộng rãi trong1 san x u a t thóc malt: 1 t â n đai m ach chỉ dù n g h ê t 40 — 200m g giberelin Đai mạch được xứ lý b ă n g giberelin có th ể r ú t ngắn thời gian t h à n h m ầm (trong quá trìn h san x u â t thóc m alt) từ 8 xuông 5 ngày, n â n g cao được h iệ u su ất, giảm giá th a n h san pham . Thóc m a lt s a n x u â t theo phương p h áp n à y d ù n g n â u bia k h ô n g làm
th a y đối cha't lượng của bia. Việc dùng giberelin tro n g s ả n x u ấ t thóc m a lt để n ấ u bia được th ô n g báo ở N h ậ t Bản từ nàm 1940, ở châu Âu từ n ă m 1958. Ngày n a y d ù n g phô biên giberelin trong công nghiệp bia ở n h iều nước n h ư Cộng h oà liên b a n g Đức, Ba Lan, H u n g a ri, Tiệp Khắc, Nga, Mỹ, Anh, N h ậ t Bản,.,. Theo th ố n g kê ồ Ba Lan, dùng chê p h ẩ m n ày làm tă n g hiệu s u ấ t và giảm giá t h à n h thóc m a lt tới 12 - 15%. Ở Anh, 90% chê p h ẩ m giberelin được dùng vào công nghiệp bia.
Sở dĩ tro n g khoai tây, các loại h ạ t giống hoặc một sô" cây cối có t r ạ n g th á i tĩn h là do tro n g các mô củẩ chúng có chứa một lượng axit apxisic cao. K hi được xử lý bằng giberelin thì lượng axit này giảm xuống, các chồi trở n ê n h o ạ t động n h ú r a khỏi h ạ t hoặc khỏi càn h h ìn h th à n h mầm, hoặc th à n h càn h lá non và s a u đó cây bước vào tr ạ n g th á i p h á t triển.
G iberelin còn có triể n vọng trong nghề trồ n g hoa. Nó là m cho cây tă n g sô" lượng hoa hoặc cho hoa nở theo thời gian quy định phụ thuộc vào điểu kiện xử lý bằng giberelin. N hà sin h lý thực v ậ t Xô viết T sa ila k h ian cho rằn g , yếu tô' nở hoa n ằm ngay ở bộ lá của cây. Dưới tác dụng của bóng tối, một số châ't h ữ u cơ được h ìn h t h à n h ở lá, rồi v ận chuyển về ngọn và làm cây nở hoa. Một tro n g các c h ấ t đó là giberelin. Khi cây được n h iễm giberelin sẽ kích thích cây đâm n h iề u bông và sớm nỏ hoa, làm th a y đổi h ìn h d á n g của th â n , cành, n h á n h và cả kích thước của n h ữ n g bông hoa.
N gày nay, giberelin đang được ứng dụng rộng rãi và ngày càng tìm th ấ y n h ững ứng d ụ n g của nó tro n g trồ n g trọ t n h ằ m tă n g n ă n g s u ấ t cây trồng. N h ư n g cũng cần phải n h ắc lại ỏ đây rằng, giberelin không ph ải c h ất kích th ích sin h trư ởn g thực v ậ t vạn năng. Việc ứng dụ n g nó cần phải th ậ n trọng, có n g h iê n cứu kỹ và đề r a n h ữ n g
Phần thứ hai