APARATOS Y MATERIAL NECESARIOS 1 INSTRUMENTAL

- Cabina de flujo laminar vertical de nivel de bioseguridad clase II.

- Centrífuga con adaptadores para viales que alcance una velocidad de 4.000 × g.

- Estufa convencional.

- Microscopio invertido, dotado de objetivos de 10, 20 y 40×.

- Cámara hematocimétrica. 6.2. MATERIALES

- Pipetas Pasteur estériles.

- Micropipetas de varios volúmenes. - Puntas de micropipeta.

- Pipetas de 5 y 10 ml estériles. - Pipetus.

- Viales estériles para shell vial.

- Cubreobjetos circulares de vidrio de 12 mm, estériles.

- Frascos de cultivo Falcon de 25 cm2 (varios proveedores).

7. PROCEDIMIENTO

7.1. CULTIVOS CELULARES: PREPARACIÓN DE VIALES shell vial

- Lavar las células eliminando el medio de cultivo y añadiendo 5 ml de solución de PBS estéril en el frasco Falcon que contiene la monocapa de células Vero.

- Tripsinizar las células añadiendo 2-3 ml de solución de tripsina-verseno, incubar a 37ºC unos segundos. - Cuando las células empiecen a despegarse, parar la tripsinización añadiendo 5-10 ml de medio de cultivo.

- Mediante una pipeta aspirar y expulsar el medio, haciendo que el líquido golpee la superficie del cultivo, con el fin de despegar las células y lograr una suspensión homogénea. Evitar, en la medida de lo posible, la formación de espuma.

- Contar las células viables en cámara hematocimétrica con azul tripán (son viables las que no permiten la entrada del colorante).

- Ajustar la suspensión a 50.000 células/ml, añadiendo medio de cultivo.

- Repartir en los viales shell vial, a razón de 1 ml por tubo.

- Colocar los tubos en la estufa a 37ºC e incubar hasta que se forme una monocapa confluente. - Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopio invertido para ver si la monocapa está bien formada y no hay contaminación.

7.2. INOCULACIÓN DE LOS VIALES

- Rotular los viales con el número de laboratorio y la fecha de inoculación.

- Antes de inocular, eliminar el medio MEM de los viales.

- Se inoculan 0,2 ml de la muestra por cada vial. - Idealmente el número de viales a sembrar será de 2 por muestra. En algunos casos, según las características clínicas y a juicio del facultativo responsable del laboratorio, se podría incrementar el número de viales.

- Centrifugar a 2.500 × g durante 30 minutos a 22ºC. - Aspirar la muestra, con cuidado de no levantar la monocapa.

- Añadir 1,5 ml de medio de cultivo e incubar a 33- 35ºC en estufa.

- Al día siguiente, visualizar los tubos al microscopio invertido para ver si la monocapa está en buenas condiciones y no existe contaminación; cambiar nuevamente el medio de crecimiento.

- Incubar a 33-35 ºC en estufa, durante 4-6 días. 7.3. SUBCULTIVO O PASE DE LOS CULTIVOS - Raspar la monocapa utilizando una punta de micropipeta o bien bolitas de vidrio estériles.

- Pasar 1ml del cultivo a un frasco Falcon de 25 cm2, en el que previamente se ha crecido una monocapa confluente de células Vero y se ha retirado el medio de cultivo.

- Rotular el nuevo frasco poniendo el número de muestra, el número de pase y la fecha de subcultivo. - Incubar 30 min. a temperatura ambiente, moviendo el frasco suavemente cada 5 min.

- Retirar el sobrenadante.

- Añadir 5 ml de medio de cultivo. - Incubar a 33-35ºC en estufa.

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Servicio de Microbiología

Hospital... Aislamiento de Rickettsia spp. a partir de muestras

clínicas mediante cultivo Edición 01 Página 4 de 4

- Al día siguiente, observar los frascos al microscopio invertido, para ver si la monocapa está en buenas condiciones y no hay contaminación.

- Incubar a 33-35 ºC en estufa.

7.4. PROCESAMIENTO DE LOS CULTIVOS.

Una vez incubado el cultivo durante 5-7 días, se raspa la monocapa y se procede a determinar si está creciendo una rickettsia mediante la tinción de Giménez, IFI con suero específico o técnicas moleculares, como la PCR. Para la identificación de la especie de rickettsia, se precisa la secuenciación de una diana específica de ADN. Aún obteniendo un resultado negativo, no se puede descartar la presencia de una rickettsia en el cultivo hasta pasados 20 días de incubación.

7.5. PUNTOS CRÍTICOS EN LA REALIZACIÓN DE LA TÉCNICA

No existen puntos especialmente críticos fuera de la realización metódica de toda técnica de laboratorio. Sin embargo, hay que tener en cuenta que los cultivos celulares se realizan en ausencia de antibióticos, por lo que hay que ser muy cuidadosos para prevenir contaminaciones. También, se deben manipular con precaución los cubreobjetos, para que no se rompan o se dañe la monocapa.

7.6. CONTROL DE CALIDAD

- El habitual de control de los reactivos.

- Cada nuevo lote de suero debe analizarse para asegurar el crecimiento adecuado de las células Vero. El resultado se señalará en el registro de control de calidad de reactivos correspondiente. 8. OBTENCIÓN Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS Un efecto citopático no indica necesariamente la presencia de una rickettsia en el cultivo. En este caso, si la realización de pruebas complementarias indica la ausencia de la bacteria, el resultado se debe expresar como "Muestra tóxica: resultado no valorable". Si con la tinción de Giménez se observara una imagen microscópica típica de crecimiento bacteriano, hay que tener en cuenta que no hay diferenciación a nivel de especie y que también pueden crecer otros microorganismos intracelulares, por lo que se deben realizar otros análisis para el diagnóstico etiológico de la infección. Los resultados de PCR e IFI en el cultivo se expresan en términos cualitativos de positivo o negativo.

9. RESPONSABILIDADES

Básicamente son las siguientes:

- Personal del área de recogida y procesamiento de muestras: recepción, identificación y procesamiento de las muestras, rechazo de las muestras remitidas en condiciones defectuosas y adopción de medidas correctoras.

- Personal técnico: control de las muestras, solicitudes y hojas de trabajo, realización de la

técnica, lectura y registro de resultados, archivo de hojas de trabajo.

- Facultativo responsable: supervisión del trabajo y de los resultados, resolución de dudas técnicas, adopción de medidas correctoras en el caso de que se hayan cometido errores, firma del informe de resultados.

10. ANOTACIONES AL PROCEDIMIENTO

La positividad del cultivo en shell vial indica la presencia de una determinada especie de rickettsia en la muestra y, por tanto, demuestra que el paciente sufre una infección activa. Para asociar la infección al cuadro clínico del paciente deben valorarse conjuntamente todos los datos clínicos y epidemiológicos.

11. LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO

El cultivo de rickettsias resulta muy laborioso y se requiere personal especializado e instalaciones con nivel de seguridad 3, por lo que su realización queda limitada a los laboratorios que cumplan de este tipo de requisitos. Además, debido a su baja sensibilidad, no se recomienda realizar este procedimiento en el caso de muestras procedentes de pacientes que hayan comenzado un tratamiento antibiótico. Todo ello hace que este procedimiento resulte poco viable en la rutina hospitalaria, por lo que debe realizarse sólo en casos seleccionados. Por otra parte, la implicación de un número creciente de especies de rickettsia en patología humana hace que no se disponga, en ocasiones, de la experiencia adecuada para la identificación de determinadas especies potencialmente patógenas. En estos casos, las muestras deberán ser remitidas a un centro de referencia.

Una limitación de la técnica es el aumento de la toxicidad de la muestra sobre la monocapa celular durante el proceso. Esto ocurre especialmente en muestras como la sangre (fracción leucocitaria) y muestras de tejidos, precisamente aquellas en las que mayor significado clínico tiene el cultivo de la bacteria.

12. BIBLIOGRAFÍA

1. Gouriet F, Fenollar F, Patrice JY et al. Use of shell-vial cell culture assay for isolation of bacteria from clinical specimens: 13 years of experience. J Clin Microbiol 2005; 10:4993-5002.

2. Parola P, Paddock CD, Raoult D. Tick-borne rickettsioses around the world: emerging diseases challenging old concepts. Clin Microbiol Rev 2005; 18:719- 56.

3. Quesada M, Sanfeliu I, Cardenosa N et al. Ten years' experience of isolation of Rickettsia spp. from blood samples using the shell-vial cell culture assay. Ann N Y Acad Sci 2006; 1078:578-581.

4. Vestris G, Rolain JM, Fournier PE et al. Seven years' experience of isolation of Rickettsia spp. from clinical specimens using the shell vial cell culture assay. Ann N Y Acad Sci 2003; 990:371-374.

DOCUMENTO TÉCNICO

PNT-EMG-08