Aplicación de técnicas metalómicas en el estudio de la

La enfermedad de Alzheimer se ha relacionado con alteraciones en el metabolismo de múltiples elementos metálicos, como se ha descrito anteriormente en la sección 1.2.7. Así, numerosos autores han propuesto la aplicación de técnicas de análisis multielemental (ionómica) para investigar

los procesos patológicos asociados a estas perturbaciones en la homeostasis de elementos tanto esenciales como tóxicos (Tabla 5).

Las anormalidades en el metabolismo del hierro, zinc y cobre son una de las señas de identidad de la metalo-biología asociada a la EA, ya que participan en las proteopatías características de esta enfermedad y en la producción de estrés oxidativo. Así, numerosos estudios han demostrado la acumulación de estos metales en distintas regiones cerebrales de pacientes afectados por EA, principalmente alrededor de los depósitos amiloideos [34, 208, 209]. Por el contrario, en fluidos biológicos como LCR y suero/plasma sanguíneo, los niveles de hierro y zinc suelen encontrarse disminuidos en EA [210-217], mientras que los niveles de cobre tienden a aumentar a lo largo de la progresión de la enfermedad [211, 212, 218, 219]. Estas alteraciones se han asociado a fallos en los mecanismos homeostáticos de transporte y almacenamiento de estos metales en el organismo [220], así como con un flujo anormal a través de la barrera hematoencefálica y el plexo coroideo [221], causando su acumulación en el cerebro.

El manganeso también se ha relacionado estrechamente con distintas enfermedades neurodegenerativas, principalmente la enfermedad de Parkinson, ya que puede promover mecanismos neurotóxicos como estrés oxidativo, disrupción mitocondrial o metabolismo alterado del glutamato y la dopamina [222]. Sin embrago, los estudios publicados sobre niveles de este metal en cerebro, LCR y sangre en pacientes con EA son muy confusos. Andrási et al. encontraron que los niveles cerebrales de manganeso variaban según la región considerada [223], mientras que otro estudio más reciente reveló un aumento de este metal en la corteza parietal [224]. Además, esta variabilidad de resultados es aún más notable en análisis de fluidos como LCR [225] y sangre [211, 212, 225-228]. En cualquier caso, existen evidencias de la implicación del manganeso en la patogénesis de esta enfermedad, ya que la actividad de algunas de las enzimas que emplean este metal como cofactor se ha encontrado reducida en pacientes de EA, como la superóxido dismutasa mitocondrial de Mn [229] y la arginasa [230].

Además de estos cuatro elementos de transición mayoritarios, otros oligoelementos esenciales podrían estar implicados en el desarrollo de la EA, entre los que destacan el vanadio [225], cromo [210, 218], molibdeno [212, 226] y cobalto [210, 212, 213, 218, 226]. Estos metales participan en múltiples procesos biológicos vitales, regulando el metabolismo de la glucosa

(V, Cr), de las purinas (Mo) y la biosíntesis de vitamina B12 (Co). Sin embargo, a día de hoy aún se desconoce cuál puede ser el papel exacto de estos elementos en la patogénesis de la EA.

Numerosos autores también han demostrado que existe una correlación negativa entre el deterioro cognitivo y los niveles de selenio y la actividad de distintas selenoproteínas en pacientes afectados por EA [44]. Así, aunque los resultados obtenidos del análisis de este metaloide en tejido cerebral no son concluyentes [208, 231-233], los niveles de selenio total en suero y plasma sanguíneo suelen encontrarse disminuidos [214, 218, 234, 235], lo cual puede ser indicativo de una respuesta protectora frente al estrés oxidativo.

Por último cabe destacar que la exposición a distintos elementos tóxicos, como el aluminio, mercurio, plomo, cadmio o arsénico, los cuales no poseen ninguna función biológica conocida, se ha propuesto como un factor de riesgo de la EA. En particular, estos elementos son especialmente perjudiciales para el cerebro ya que, a diferencia de otros metales funcionales, su homeostasis no está tan estrechamente regulada. Los efectos neurotóxicos más importantes del aluminio y el plomo son su capacidad de desencadenar la formación de placas seniles y ovillos neurofibrilares, provocar fallos en la neurotransmisión y la inducción de estrés oxidativo [43, 236]. Alternativamente, se ha demostrado que la exposición a mercurio y arsénico induce la aparición de rasgos patológicos propios de la EA [237, 238]. Además, tanto el plomo como el cadmio provocan la disminución del contenido cerebral de acetilcolina [239, 240], un neurotransmisor comúnmente asociado a la EA. En este contexto, numerosos estudios han relacionado la aparición de la EA con un incremento en el contenido total de aluminio en cerebro [42, 209] y sangre [211, 218, 228, 241]. Del mismo modo, los niveles de mercurio también se han encontrado incrementados en pacientes de EA en ambas muestras biológicas [208, 211, 212, 225, 226, 242]. Por el contrario, sólo algunos autores han informado de cambios significativos en los niveles de cadmio [211, 212], plomo [225, 235] y arsénico [217, 228], por lo que su implicación en la patogénesis de la EA es más dudosa.

Tabla 5. Antecedentes bibliográficos de la aplicación de técnicas metalómicas para el

estudio de la enfermedad de Alzheimer.

elemento resultados Ref.

Fe ↑cerebro [34], [208], [209] ↓LCR [210] ↓suero/plasma [211], [212], [213], [214] Zn ↑cerebro [34], [208], [209] ↓LCR [215], [216] ↓ suero/plasma [212], [213], [214], [217] Cu ↑cerebro [34], [209] ↑LCR [211] ↑suero/plasma [212], [218], [219] Mn ↑↓cerebro [223], [224] ↓LCR [225] ↑↓suero/plasma ↑[212], [225], [226], [227]; ↓[211], [228] V ↓LCR [225] Cr ↑LCR [210] ↓suero/plasma [218] Mo ↓suero/plasma [212], [226] Co ↑LCR [210] ↑↓suero/plasma ↑[226]; ↓[212], [213], [218] Se ↑↓cerebro ↓[231], [232]; ↑[208], [233] ↓suero/plasma [214], [218], [234], [235] Al ↑cerebro [42], [209] ↑suero/plasma [211], [218], [228], [241] Hg ↑cerebro [208], [242] ↑suero/plasma [211], [212], [225], [226] Pb ↓LCR [225] ↓suero/plasma [235] Cd ↓LCR [211] ↑suero/plasma [211], [212] As ↓suero/plasma [217], [228] 75

Las limitaciones asociadas a las actuales pruebas de diagnóstico de la enfermedad de Alzheimer hacen de vital importancia el descubrimiento de nuevos biomarcadores sensibles y específicos, para lo cual es necesario profundizar en el conocimiento de la etiología exacta de este trastorno neurodegenerativo. Con este propósito, las técnicas ómicas presentan un gran potencial ya que permiten caracterizar de forma integral las perturbaciones bioquímicas asociadas al desarrollo de la enfermedad.

De este modo, el objetivo principal de esta Tesis fue el estudio de los mecanismos patológicos asociados a la enfermedad de Alzheimer, así como el descubrimiento de potenciales biomarcadores para su diagnóstico, mediante la aplicación de técnicas metabolómicas y metalómicas. Para ello, los objetivos específicos de los trabajos que componen esta Tesis se pueden resumir en tres puntos.

1. Caracterización de las alteraciones metabólicas y metalómicas asociadas a

la patogénesis de la enfermedad de Alzheimer y su progresión desde el deterioro cognitivo leve mediante análisis de suero sanguíneo (Capítulos

1-3).

2. Análisis metabolómico de suero, cerebro y órganos periféricos del ratón

transgénico APP/PS1 para caracterizar de forma integral las perturbaciones metabólicas asociadas a la enfermedad de Alzheimer (Capítulo 4).

2.1. Validación del modelo transgénico APP/PS1 mediante la comparación

de los perfiles metabolómicos de suero de ratones y pacientes humanos.

2.2. Estudio de las alteraciones neuroquímicas asociadas al desarrollo de la

enfermedad de Alzheimer en distintas regiones cerebrales: hipocampo, corteza cerebral, estriado, cerebelo y bulbos olfatorios.

2.3. Evaluación de la implicación del sistema periférico en el desarrollo de

la enfermedad de Alzheimer mediante análisis metabolómico de muestras de hígado, riñón, bazo y timo.

3. Estudio de los mecanismos patológicos asociados a la inflamación en la

enfermedad de Alzheimer mediante el empleo del modelo transgénico de función inmune deteriorada APP/PS1/IL4-KO (Capítulo 5).

Para lograr estos objetivos se optimizaron múltiples procedimientos analíticos complementarios basados en espectrometría de masas para llevar a cabo el análisis metabolómico, lipidómico y metalómico de diversos tejidos y fluidos biológicos.

1. Desarrollo de plataformas metabolómicas y lipidómicas basadas en

análisis directo mediante espectrometría de masas (DI-ESI-MS, FIA- APPI-MS).

2. Desarrollo de plataformas metabolómicas basadas en el acoplamiento de

técnicas de separación ortogonales y espectrometría de masas (UHPLC- MS, GC-MS, CE-MS).

3. Desarrollo de un procedimiento metalómico basado en el fraccionamiento

de metalo-especies mediante precipitación de proteínas en condiciones no desnaturalizantes y posterior análisis mediante ICP-MS.