Búsqueda de biomarcadores

Con el objetivo de encontrar potenciales biomarcadores compartidos, se compilaron los resultados de los 3 experimentos (“Orgánico vs Convencional”, “Fertilizantes” y “Basket Survey”) bajo condiciones equiparables (ORG-COMP-BORG y CON-UREA-BCON), buscando iones que a pesar de los cambios en condiciones de cultivo y manejo, se

mantuvieran con un comportamiento diferenciado con respecto al resto de las señales en dependencia únicamente del manejo agronómico y la fuente de nitrógeno usada.

Encontramos iones con este comportamiento en iones tanto positivos como negativos (Figura 32), ejemplos de este comportamiento es el ion con valor de m/z de ~116 que aparece de manera más intensa en condiciones de ORG-COMP-BORG (Figura 32a,b,c), así como el ion con valor de m/z ~203 que aparece de manera más intensa en las distintas repeticiones de CON-UREA-BCON (Figura 32d,e,f).

Figura 32 Boxplots de iones marcadores metabólicos compartidos por los 3 experimentos anteriores. (a), (b) y (c) mz~116 con ionización positiva. (d), (e) y (f) mz~ 203 con ionización positiva. Para (a) y (d): (CON) = Manejo convencional (ORG) = Manejo orgánico. Para (b) y (e): (CONT)= Control,

(COMP)= composta, (AMMO)= sulfato de smonio, (NITR)= nitrato de potasio, (UREA)= urea. Para (c) y (f): (BCON)= Basket Convencional (BORG) = Basket Orgánico. n = 54.

7. Discusión

Experimento Órganos

A partir del agrupamiento de las muestras en el dendrograma de comparación de las huellas metabólicas de los distintos órganos de la planta de jitomate pudimos observar que se generaron 3 clados principales, uno correspondiente a las muestras de raíz, otro clado correspondiente a las muestras de fruto, y otro clado correspondiente a las muestras provenientes de tallo y hojas; éste último clado a su vez se dividió en 2 clados independientes correspondientes a cada tejido (hoja y tallo). Era de esperarse la distinción de las muestras de acuerdo a sus huellas metabólicas, ya que tantos sus funciones, morfología y presencia de metabolitos fueron muy distintas (Figura 13).

Un fenómeno interesante fue notar las similitudes existentes entre las huellas metabolómicas de las muestras de tallo y hoja. Esto puede estar ocasionado por el hecho de que ambos órganos presentan actividad fotosintética, lo que implica una alta concentración de clorofila (Hetherington et al., 1998), así como porque ambos órganos están involucrados en procesos de producción y distribución de carbohidratos en la planta (Juarez-Colunga et al., 2018). En cuanto al clado correspondiente al fruto, éste fue el único clado en donde se generaron 2 subclados dependientes del manejo agronómico (Orgánico y Convencional). Esto quiere decir que las similitudes entre las huellas metabolómicas de los distintos órganos fue suficiente para distinguirlos, pero que a su vez las muestras de frutos orgánicos fueron suficientemente diferentes para generar su propio subclado independiente (Figura 13). Una vez que notamos las diferencias en las huellas metabólicas de frutos dependientes del manejo agronómico procedimos a disectar los frutos para conocer cuál era el tejido que más variaciones presentaba con respecto a su metaboloma y poder atribuirle causas a estos cambios (Figura 14).

De nuevo, se observó que los agrupamientos de las muestras se dividieron de acuerdo al tejido, lo que indica que tanto la técnica como los métodos de análisis fueron suficientemente sensibles para detectar las diferencias entre las huellas metabólicas de los distintos tejidos (Figura 14).

Analizando los agrupamientos generados (Figura 14), se pudo observar que en ninguno de los casos de tejidos independientes se dio un subagrupamiento de acuerdo al manejo agronómico. Esto contradice algunos reportes de toxicidad que indican que los tejidos más expuestos al manejo agronómico (raíz, hojas y cáscara del fruto) suelen presentar actividad residual de plaguicidas detectables por espectrometría de masas (Thurman et al., 2005), y a su vez podría parecer contra-intuitivo si se piensa en el fruto como la suma de sus tejidos individuales; sin embargo, tomando en cuenta el efecto sinérgico y la correlación entre los diferentes tejidos del fruto citada por Toubiana et al. (2012) observamos que estos efectos fueron detectables por esta técnica y nos permiten distinguir entre frutos completos cultivados bajo distintos manejos agronómicos.

Fue por lo anterior que para el resto de los experimentos se decidió comparar muestras de fruto, ya que éstas presentaban la mayor plasticidad dentro de su huella metabolómica, así como mayores variaciones ocasionadas por los distintos manejos agronómicos.

Experimento “Orgánico vs Convencional”

Los resultados de rendimiento de fruto obtenidos coincidieron con los rendimientos reportados para esa variedad bajo condiciones de invernadero bajo ambos manejos (Pacheco et al., 2018) (Figura 16a,b,c ), por lo que podemos asegurar que las condiciones de cultivo fueron las adecuadas.

Las diferencias significativas detectadas tanto en peso seco como en peso fresco entre los distintos manejos agronómicos (Figura 16a,b,c) coinciden con lo reportado en diversos estudios con múltiples hortalizas (Togun y Akanbi, 2003) (Kapoulas et al., 2011); este fenómeno es explicado por Elia et al. (2007) que citan la adición de urea como un componente de desbalance osmótico que introduce una mayor cantidad de agua a la célula. Este fenómeno ha sido evaluado también por medio de paneles de pruebas a ciegas en donde se citan frutos cultivados con algunos fertilizantes convencionales como “más grandes pero con menos sabor” (Casals et al., 2018), lo que también se nota en la Figura 16d.

Se observó una reproducibilidad muy alta entre los resultados de los 3 años de cultivo, por lo que se consideró que las condiciones tanto ambientales como de cultivo son comparables para el resto de los experimentos analíticos (Figura 16).

No se observaron diferencias significativas en los niveles de carbohidratos solubles (glucosa, fructosa y sacarosa) entre los distintos manejos agronómicos; esto coincide con los reportes citados en los antecedentes en donde en un meta-análisis de artículos comparativos no se encontraron diferencias significativas entre niveles de carbohidratos en distintos cultivos bajo manejos orgánicos y convencionales (Bourn y Prescott, 2002) (Figura 17a,b,c).

Se observó que la sacarosa fue el carbohidrato soluble que se encontró en menor concentración en el fruto, comparado con glucosa y sacarosa (Figura 17a,b,c). Esto se encuentra referenciado a menudo en otros artículos (Missio et al., 2015).

Tampoco se observaron diferencias significativas en los niveles de aminoácidos totales en fruto entre los distintos manejos agronómicos (Figura 17d), lo que se relaciona con lo reportado en los antecedentes de este trabajo (Bourn y Prescott, 2002).

El conjunto de resultados anteriores nos llevó a pensar que los cambios observados en las huellas metabólicas de los frutos bajo distintos manejos agronómicos estaba relacionado con modificaciones en el metabolismo secundario de las plantas, viéndose estos cambios reflejados en la gran cantidad de metabolitos presentes en el fruto.

Una vez analizadas las huellas metabolómicas de las muestras bajo manejo agronómico orgánico o convencional se procedió a compararlas (Figura 18); se encontraron 1,647 iones con comportamiento significativamente distinto entre los distintos manejos agronómicos, y de éstos 1,028 se detectaron bajo el modo de ionización positiva y 619 bajo ionización negativa. En ambos casos se detectó mayor cantidad de iones más abundantes bajo manejo orgánico, 547 en modo positivo y 145 en modo negativo, contra 12 en modo positivo y 21 en modo negativo para muestras bajo manejo convencional. Este efecto de mayor detección en frutos orgánicos podría estar relacionado con lo citado por Garcia et al. (2017) que mencionan que los cultivos producidos bajo manejo orgánico tienen una mayor concentración de ácidos orgánicos y, por lo tanto, menor pH, lo que podría favorecer la ionización de las muestras en análisis de espectrometría de masas (Nielsen et al., 2017). La comparación de los 50 iones más abundantes mediante un heatmap bicluster generó 2 agrupamientos muy claros de la muestras dependiendo de su manejo agronómico (Figura 19). Dentro de estos clados no se observó ningún agrupamiento dependiente del año de cultivo o

replica biológica, lo que nos hace pensar que si bien los cambios dependientes de año de réplica son muy pequeños como para agruparse dentro del clado, los cambios ocasionados por el manejo agronómico son suficientemente altos para generar agrupamientos.

Se observó también un agrupamiento de distintos iones de forma horizontal (Figura 19 izquierda); estos agrupamientos se generan cuando distintos iones presentan un comportamiento similar bajo los distintos tratamientos y pueden ayudar a encontrar metabolitos relacionados o incluso rutas biosinteticas que se activen o desactiven bajo algún tratamiento en particular (Garcia-Flores et al., 2015).

En la búsqueda de iones independientes que permitieran distinguir entre distintos manejos agronómicos y que tuvieran potencial de servir como biomarcadores del manejo agronómico, se buscó dentro de la lista de iones con potencial de servir como marcador (Figura 18) aquellos que tuvieran un comportamiento binario (presentes bajo un manejo y completamente ausentes en el otro). Los iones que estuvieron presentes con este comportamiento se encontraron principalmente con un modo de ionización negativa para el caso de muestras de manejo orgánico (Figura 20a,b,c); esto se relaciona con lo mencionado anteriormente que sugiere un menor valor de pH en cultivos orgánicos como facilitador de la ionización de algunos de sus metabolitos (Nielsen et al., 2017). Pare el caso de muestras bajo manejo convencional, se encontraron estos iones binarios presentes tanto en modos de ionización positiva (Figura 20d,f), y negativa (Figura 20e).

Experimento “Fertilizantes”

La evaluación de rendimiento en peso fresco de las muestras tratadas con los distintos fertilizantes no mostró diferencias significativas entre los tratamientos (Figura 21a), con excepción del tratamiento control (sin fertilización); esto nos indicó que bajo ninguno de los tratamientos se presentaron condiciones de estrés por falta o exceso de macro o micro nutrientes en las plantas. En general, durante todo el experimento las condiciones fisiológicas y apariencia de las plantas fue la misma (datos no mostrados).

Se repitió el comportamiento mostrado en el experimento “Orgánico vs Convencional” y reportado por Casals et al. (2018) en donde las plantas bajo manejo agronómico orgánico, en este caso fertilizadas con composta, tenían un mayor peso seco comparadas con las

fertilizadas con fertilizantes convencionales (químicos) sulfato de amonio, nitrato de potasio y urea Figura 20b,c).

En este experimento al comparar los iones con comportamiento diferenciado entre los distintos tratamientos se encontraron 2,935 iones, 945 positivos y 1,990 negativos (Figura 22). El tratamiento con composta generó la mayor cantidad de biomarcadores con 709 en total (285 positivos y 424 negativos); esto podría ser causado por la diferencia de formulación y otras moléculas presentes que existían entre este tratamiento y el resto de los tratamientos con fertilización química, ya que al tratarse de un fertilizante con mayor número de impurezas o moléculas distintas al nitrógeno, éste podría estar induciendo reacciones diferenciales en la planta. El segundo tratamiento con mayor número de biomarcadores fue el tratamiento control con 659 en total (243 positivos y 416 negativos); esto se entiende si se toma en cuenta que el tratamiento control no fue suplementado con nitrógeno adicional al presente en el peat moss, lo cual podría haber generado condiciones de estrés (también observadas en la (Figura 19) que a su vez posiblemente desencadenaron reacciones metabólicas en la planta que pudieron ser detectadas con este método, lo cual coincide con lo reportado en otros cultivos como maíz bajo condiciones de bajo nitrógeno (Garcia-Flores et al., 2012). Para el caso de la fertilización con sulfato de amonio y nitrato de potasio, la mayoría de su iones marcadores aparecieron bajo ionización positiva, mientras que para los tratamientos con fertilización con urea la mayoría de los marcadores se encontraron bajo ionización negativa; esto puede haber sido ocasionado por la facilidad de algunas sales y minerales para formar aductos que generan señales únicas en el espectrograma, o por la facilidad para ceder o recibir electrones en un entorno químico particular (Li y Huang, 2014).

Comparando 50 de los iones más abundantes de este experimento mediante un heatmap bicluster se generaron en primer lugar 2 agrupamientos muy claros, uno correspondiente a las muestras del tratamiento control y el otro a los tratamientos fertilizados (Figura 23); esto pueda haber sido ocasionado por las reacciones metabólicas diferenciadas que ocurren en el fruto de jitomate bajo condiciones de estrés por falta de nitrógeno. En el clado restante se observaron 2 agrupamientos, uno para las muestras fertilizadas con nitrato o amonio, y otro grupo para las fertilizadas con urea y composta; esto nos sugiere una similitud de reacciones en la planta bajo estos tipos de fertilización, y presumimos que el agrupamiento entre

composta y urea se pudo haber ocasionado por la presencia de trazas de urea de origen animal en la mezcla de la composta. Dentro de cada uno de estos grupos se formaron clados independientes dependiendo del fertilizante usado sin agrupamientos con base en el año de cosecha o la réplica biológica, lo que indica una fuerte dependencia del fertilizante por parte de la huella metabolómica.

Se observó también un agrupamiento de distintos iones de forma horizontal (Figura 23 izquierda), en 2 grupos principales, y dentro de éstos se podrían identificar iones que incrementaron su presencia al ser fertilizados particularmente con composta, así como aquellos que disminuyeron en presencia de fertilización con nitrógeno. Consideramos que estos iones pueden estar relacionados con respuestas a estrés por bajo nitrógeno.

En este experimento, por sus múltiples tratamientos, fue más difícil encontrar manualmente biomarcadores que solo estuvieran presentes en un tratamiento de fertilización, en este experimento únicamente encontramos este tipo de marcadores en los tratamientos control (Figura 24c,d); esto podría estar relacionado con la fuerte respuesta a estrés por falta de nitrógeno (Stewart et al., 2001). Para el resto de los tratamientos encontramos potenciales biomarcadores que presentaron niveles significativamente más altos en algún tratamiento por sobre el resto (Figura 24a,b,e,f). Para todos los tratamientos, excepto el tratamiento con nitrato de potasio, encontramos biomarcadores tanto en modo de ionización positiva como negativa (Figura 25), mientras que para las muestras con fertilización con nitrato de potasio no se encontraron marcadores en modo de ionización negativa, lo que coincidió con lo encontrado en el análisis de biomarcadores (Figura 23).

Con la lista de todos los biomarcadores elaborada en base a la metodología de Random Forest se elaboró un heatmap bicluster para identificar los grupos de iones que se detectaban de manera diferenciada bajo los diferentes tratamientos de fertilización (Figura 26 derecha), ahí se pudieron distinguir grupos de iones con respuestas especificas a los diferentes tratamientos de fertilización; esto puede servir de base para en un estudio posterior identificar cada uno de esos metabolitos o analizar las rutas biosinteticas relacionadas con estas respuestas. Como otra aproximación para la distinción de los diferentes tratamientos de fertilización y el eventual hallazgo de iones con potencial como biomarcador, se elaboró un análisis de componentes principales (Figura 27). En éste se observó que el grupo de datos

correspondientes al tratamiento control se encontraba muy separado del resto de los tratamientos, por debajo y a la izquierda de la media, mientras que el resto de los tratamientos se distribuyeron entre el resto de los cuadrantes. Con este análisis fue imposible determinar iones que discriminaran entre tratamientos fertilizados, mientras que se reafirmó la idea de que el efecto de estrés por falta de nitrógeno fue mucho más fuerte que los efectos ocasionados por el tipo de fertilización, lo que coincide con lo reportado por múltiples autores (Claussen, 2002) (Ben-Oliel et al., 2004), aunque aun así, estos efectos ocasionados por la fuente de fertilización son distinguibles por otras metodologías.

Análisis combinados de experimentos en invernadero

Al comparar los iones considerados como biomarcadores en ambos experimentos (“Orgánicos vs Convencionales” y “Fertilizantes”) se notó que existían algunos de estos que se repetían, por lo que fueron distribuidos en un diagrama de Venn para observar su distribución (Figura 28). Se observó que la gran mayoría de los iones considerados como marcadores de manejo orgánico, aparecían también como marcadores de alguno de los tratamientos de fertilización, principalmente con los tratamientos control y composta (Figura 28 arriba), mientras que la gran mayoría de los iones identificados como biomarcadores de manejo convencional no se repitieron en los tratamientos de fertilización. Fue interesante notar la gran cantidad de iones que aparecieron como biomarcadores para el tratamiento con nitrato de potasio (KNO3) y que no se compartieron con ninguno de los tratamientos de manejo orgánico o convencional; esto puede estar ocasionado por la propensión de metabolitos producidos con este fertilizante a asociarse con sodio y formar aductos no formados bajo el resto de los tratamientos al momento de la ionización. Bajo el mismo principio se elaboró una gráfica que presentaba la lista de los 15 iones más abundantes dentro de cada una de las categorías (Figura 29); se observa que estos iones aparecieron tanto en los modos de ionización positiva o negativa, sin embargo en ninguno de los casos apareció el mismo ion en la misma sección del diagrama de Venn (incluso tomando en cuenta el ajuste al peso molecular en cada una de las ionizaciones). Esto reafirma la idea de que una señal de mz no siempre representa únicamente una molécula o metabolito y que la formación de iones y su detección es muy dependiente de la estructura y naturaleza molecular de cada uno de estos metabolitos (Fukusaki y Kobayashi, 2005).

Se buscó analizar el conjunto de todos los datos experimentales por medio de un PCA con la intención de identificar iones biomarcadores, y también si tratamientos cercanos (Orgánico- Composta y Convencional-Urea) se agrupaban de alguna manera (Figura 30). Se observó que los tratamientos Orgánico y Convencional se distinguían muy claramente, mientras que los grupos conformados por los distintos tratamientos de fertilización no se distinguían muy claramente entre ellos. Fue interesante notar como a pesar de no estar completamente empalmados, los grupos formados por los tratamientos Orgánico y composta se agruparon del lado izquierdo de la gráfica, mientras que los tratamientos Convencional y Urea se agruparon del lado derecho; esto nos indica que los elementos del primer componente (Figura 30 eje x) fueron más discriminantes hacia este tipo de tratamientos, mientras que el segundo componente fue más discriminante hacia el experimento “Orgánico vs Convencional” o “Fertilizante”. Esto indicó que, si bien la fuente de fertilización con N es muy importante en la formación de huellas metabólicas y su eventual discriminación, no es el único factor a tomar en cuenta.

Análisis comercial (Basket Survey)

Para conocer qué tanto el modelo de discriminación elaborado con los experimentos anteriores (“Orgánico vs Convencional” y “Fertilizantes”) era replicable en muestras donde nosotros no controlábamos las condiciones de manejo, así como para ubicar iones biomaracadores que mantuvieran su función discriminante en estas muestras externas, se analizaron con la metodología DIESI-MS muestras comerciales de jitomate tanto orgánico como convencional de distintos orígenes.

Al acomodar las huellas metabolómicas de estas muestras comerciales mediante un análisis de heatmap bicluster con 50 de los iones más representativos, se observó que se generaban dos clados principales (Figura 31): por un lado las muestras certificada como orgánicas, y por otro las muestras de origen convencionales. Además, se observó que se formaron 2 grupos de iones (Figura 31 eje X) correspondiendo uno de estos grupos a señales de iones que aumentaron en muestras bajo cultivo orgánico. Con un estudio más amplio de este tipo de muestras a lo largo de varios años se podría enriquecer un modelo predictivo de manejo agronómico en producto final.

Se elaboró una búsqueda manual de iones marcadores compartidos entre las 3 condiciones comparables; si bien no existieron muchas coincidencias, principalmente por la diversidad de condiciones de cultivo entre las muestras de los análisis comerciales y los ensayos de invernadero, se encontraron iones candidatos que presentaron un comportamiento diferenciado en los 3 experimentos (Figura 32), es importante hacer notar que mientras el ion mz=116 no apareció en el heatmap bicluster del Basket Survey como uno de los iones más abundantes (Figura 31), en la búsqueda manual sí se observó este comportamiento diferenciado. Por otra parte, el ion mz=203 sí apareció como discriminante tanto en la búsqueda manual como en el heatmap bicluster, lo que resalta la importancia de seguir múltiples técnicas y enfoques para la búsqueda de iones biomarcadores en base a datos de