Búsqueda de factores regulatorios del SST6

Con el propósito de examinar los mecanismos regulatorios que gobiernan la expresión transcripcional del SST6, se conjugó el plásmido reportero fluorescente a una serie de cepas mutantes de S. marcescens RM66262 y se midieron los niveles de fluorescencia emitida por GFP, normalizados por la DO600nm, luego de cultivar las cepas a dos temperaturas distintas. Se evaluó la cepa mutante tssM para examinar si hay una retroalimentación en la regulación del SST6. Considerando que previamente se reportó que en V. cholerae la cascada regulatoria flagelar controla la expresión del SST6 (199), se decidió utilizar cepas mutantes en flhD (regulador flagelar maestro) y fliA (factor sigma alternativo de la ARN polimerasa σ28_{). Puesto} que el SST6 de Edwarsiella tarda está regulado por el sistema de transducción de señales PhoPQ (200), se incluyó a la mutante en phoP en los ensayos. Además, se decidió ensayar la mutante en rcsB, el regulador de respuesta del sistema regulador global Rcs, ya que en el laboratorio se reportó que dicho sistema regula diversos fenotipos en Serratia, incluyendo la motilidad mediada por flagelo (58), la producción de hemolisina (21) y la secreción de OMVs (129). Por último, y considerando que muchos de los genes regulados por el sistema Rcs también son regulados por el sistema CpxRA, se incluyó la cepa mutante en cpxR.

No se observaron diferencias estadísticamente significativas entre los niveles de expresión transcripcional que presentan las mutantes al compararlas con la cepa silvestre, excepto en el caso de la mutante rcsB (Figura IV.6). Este resultado indica que, en las condiciones ensayadas, la expresión del SST6 no está regulada a nivel transcripcional por el Figura IV.5. Evaluación de la termorregulación de la transcripción del SST6. Se cultivaron las cepas de S. marcescens (Sma) A) RM66262 o B) Db10 durante 16 h con o sin agitación constante a 30°C o 37°C, según lo indicado. Las cepas contienen el plásmido reportero transcripcional ppromSST6. Se midieron los niveles de fluorescencia emitida por GFP (UF) y la DO600nm y se graficó la relación UF/DO600nm. Se muestran los promedios ±

Capítulo I - Resultados

71 sistema CpxRA, el sistema PhoPQ y la cascada regulatoria flagelar, y que no existe una retroalimentación en la regulación del SST6. En contraste, el resultado obtenido para la mutante rcsB permite inferir que el sistema Rcs es un activador de la expresión del SST6, ya que se obtiene un nivel transcripcional un 29% o 35% menor que el obtenido para la cepa silvestre a 30°C o 37°C, respectivamente (Figura IV.6).

Figura IV.6. Búsqueda de factores regulatorios del SST6 utilizando el plásmido reportero transcripcional. Se cultivaron las cepas indicadas de S. marcescens RM66262 durante 16 h con agitación constante a 30°C o 37°C, según lo indicado. Las cepas contienen el plásmido reportero transcripcional ppromSST6. Se midieron los niveles de fluorescencia emitida por GFP (UF) y la DO600nm y se graficó la relación

UF/DO600nm. Se muestran los promedios

± S.D. para tres ensayos independientes (** p<0,01 y *** p<0,001). Se calcularon las diferencias estadísticas respecto al valor obtenido para la cepa silvestre, en cada condición.

Para corroborar la disminución en la actividad transcripcional observada en la mutante rcsB, se realizaron ensayos de RT-qPCR para evaluar los niveles de transcripto de los genes vgrG y hcp. Se extrajo ARN de la cepa silvestre y de la mutante rcsB crecidas a 37°C hasta fase exponencial y se llevó a cabo la retro-transcripción. Se realizó la real time PCR con los siguientes pares de oligonucleótidos: vgrGRTFw y vgrGRTRv; hcpRTFw y hcpRTRv. La expresión relativa de los genes vgrG y hcp en la cepa mutante rcsB se encuentra reducida un 60% y 40%, respectivamente, en comparación con la cepa silvestre (Figura IV.7). De este modo, se puede corroborar el fenotipo observado en los ensayos de actividad transcripcional realizados utilizando el plásmido reportero ppromSST6.

Figura IV.7. Cuantificación de los transcriptos de vgrG y hcp mediante RT-qPCR. Se extrajo ARN total de las cepas S. marcescens silvestre (wt) o mutante rcsB crecidas hasta fase exponencial a 37°C. Se midió la expresión de A) vgrG y B) hcp por RT-qPCR utilizando oligonucleótidos específicos. Los valores se obtuvieron por método del 2-ΔΔCT, utilizando los niveles de transcripto del gen 16S como referencia. Se normalizó la expresión de los genes, considerando el valor obtenido para la cepa silvestre como la unidad. Se muestran los promedios ± S.D. para tres ensayos independientes (** p<0,01 y *** p<0,001). Se calcularon las diferencias estadísticas respecto al valor obtenido para la cepa silvestre.

Dado que los ensayos de competencia interbacteriana son realizados en medio sólido, se examinó si se conserva la regulación transcripcional del SST6 RcsB-dependiente al realizar

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72 los ensayos con el reportero transcripcional en una placa de LB-agar. Para ello, se incubaron las cepas S. marcescens silvestre o rcsB en medio sólido a 37°C y, a los tiempos indicados, se recuperaron las muestras y se midieron los niveles de fluorescencia emitida por GFP, normalizados por la DO600nm.

Como se puede observar en la Figura IV.8, la regulación transcripcional del SST6 dependiente de RcsB se verifica al realizar los ensayos en medio sólido. Por lo tanto, el reportero fluorescente ppromSST6 constituye una herramienta adecuada para ser utilizado en las condiciones de ensayos de competencia interbacteriana.

Figura IV.8. Regulación transcripcional del SST6 en medio sólido. Se cultivó S. marcescens RM66262 silvestre (wt) o mutante rcsB durante 16 h con agitación constante a 37°C. Las cepas contienen el plásmido reportero transcripcional ppromSST6. Se sembró una dilución de dicho cultivo en una placa de LB-agar y se la incubó a 37°C durante la cantidad de h indicadas. Posteriormente, las bacterias se recuperaron y se midieron los niveles de fluorescencia emitida por GFP (UF) y la DO600nm y se graficó la relación

UF/DO600nm. Se muestran los promedios ± S.D.

para tres ensayos independientes (* p<0,05). Se calcularon las diferencias estadísticas respecto al valor obtenido para la cepa silvestre a cada tiempo.

Puesto que la regulación RcsB-dependiente se detectó a nivel transcripcional, se analizó a su vez si alguno de los reguladores estudiados modifica la actividad del SST6 de forma post-transcripcional. Para ello, se cultivaron las cepas anteriormente indicadas durante 16 h a 37°C con agitación. Los sobrenadantes de dichos cultivos se concentraron por precipitación con TCA y se separaron mediante un SDS-PAGE. Posteriormente, se realizó una inmunodetección con un anticuerpo anti-Hcp y un gel equivalente sembrado del mismo modo se tiñó con Coomassie como control de carga. Los niveles de Hcp secretado se cuantificaron mediante densitometría. Como se mencionó previamente, detectar menores niveles de Hcp secretados indica una menor actividad del SST6.

En la Figura IV.9 se puede observar que las cepas mutantes en fliA, flhD, cpxR y phoP presentan niveles de Hcp secretados similares a los de la cepa silvestre. Por ende, se puede inferir que el SST6 no está controlado de forma post-transcripcional por los sistemas CpxRA, PhoPQ y por la cascada regulatoria flagelar, en las condiciones ensayadas. En contraste, la mutante rcsB presenta menores niveles de Hcp secretado que la cepa silvestre y este fenotipo se complementa al expresar rcsB desde un plásmido (Figura IV.9B). Estos resultados son congruentes con los observados en el ensayo de actividad transcripcional Figura IV.6 y Figura IV.7), ya que la mutante rcsB tiene un menor nivel transcripcional del SST6 que la cepa silvestre. En consecuencia, se puede concluir que RcsB actúa como un activador de la

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73 transcripción del cluster génico del SST6, modulando su actividad.

Figura IV.9. Búsqueda de factores regulatorios del SST6 mediante secreción de Hcp. Se cultivaron las cepas indicadas durante 16 h con agitación constante a 37°C. Los sobrenadantes de cultivos se filtraron, concentraron por precipitación con TCA y resuspendieron en solución de siembra desnaturalizante. Las muestras se separaron mediante un SDS-PAGE al 15% y se realizó una transferencia y posterior inmunodetección con un anticuerpo policlonal anti-Hcp (panel medio). Un gel equivalente sembrado del mismo modo se tiñó con Coomassie como control de carga (panel superior). En la parte inferior de la figura se muestran los niveles de Hcp secretado cuantificados por densitometría y relativos al valor obtenido para la cepa silvestre. Se indican los promedios ± S.D. para tres experimentos independientes (** p<0,01 y *** p<0,001). Se calcularon las diferencias estadísticas respecto al valor obtenido para la cepa silvestre. Se muestran imágenes representativas de los geles. Se cortaron distintas calles del mismo gel (indicado con líneas de puntos) para excluir otras cepas ensayadas. MPM: Marcador de peso molecular.