BACTERIÓFAGO Qβ COMO HERRAMIENTA EN BIOTECNOLOGÍA.

El bacteriófago Q pertenece al género Allolevivirus (grupo B) [148] dentro de la familia Leviviridae

que incluye a los virus con genoma de ARN más pequeños conocidos. Infectan a cepas deEscherichia coli

(E.coli) F+_{, a las que ingresan uniéndose al pili [13, 149]. Su genoma es de ARN simple hebra con sentido}

positivo de 4.219 nucleótidos que codifica para una replicasa y 3 proteínas estructurales:i) la proteína de

maduración (pMa) de 421 AA,ii) la proteína mayor de la cubierta (pC) de 133 AA yiii) la proteína A1 de

329 AA [150] (Figura 12). Su cápside es de geometría icosaédrica y consiste mayoritariamente de la proteína de la cubierta, algunas moléculas de la proteína A1 y una copia de la pMa que media la interacción con el pili del hospedador. Debido a que la mayor parte del genoma del fago es codificante

(90%), las secuencias que actúan en cis se superponen con los dominios codificantes [151]. De esta

manera en el genoma está almacenada la información para la síntesis de las proteínas necesarias para la

replicación, encapsidación, infección y lisis celular, pero además la secuencia per seasegura el correcto

plegamiento del ARN genómico.

Figura 12: Regiones codificantes y no codificantes en el genoma de Q.

Se marcan abajo las zonas involucradas en la formación de estructuras secundarias que cumplen funciones regulatorias.

pMa: proteína de maduración. pC: proteína mayor de la cubierta. pA1: proteína A1.

Se ha utilizado este bacteriófago, así como a otros miembros de la familia Leviviridae, como

instrumentos para la expresión de epitopes en la proteína C [152]. En Qse ha visto que las inserciones

en la región C-terminal de la proteína A1 no alteran la formación y ensamblado de partículas fágicas, obteniéndose de esta manera cápsides recombinantes expresando, por ejemplo, epitopes preS1 del HBV [148] y de la enzima dihidrofolato reductasa [153]. La comparación por microscopía electrónica de las

cápsides de los viriones de Q y de las recombinantes, reveló una alta similitud en su naturaleza

icosaédrica [148].

Otra aplicación del fago Qcomo herramienta biotecnológica proviene de nuestro laboratorio. Hemos

construido un derivativo de Qpara ser utilizado como CIC para su uso en la detección cualitativa del

ARN del HCV a través del ensayo RT-PCR-HCV/CICHCV[154]. El CICHCVconsiste en un fago Qrecombinante

del ARN-HCV. Según nuestra estrategia, el CICHCV es añadido a la muestra de plasma, procesado

conjuntamente con el ARN viral y amplificado por RT-PCR utilizando el mismo par de cebadores que para HCV. Posteriormente, los amplicones resultantes son discriminados mediante hibridación líquida con

sondas específicas para cada target y detección colorimétrica en formato EIA. El CICHCV demostró ser

estable por al menos 452 días a 4°C y por 125 días luego de su reconstitución a partir del liofilizado [154].

El sistema RT-PCR-HCV/CICHCVpuede detectar 500 UI/ml de ARN-HCV, todos los genotipos presentes

en Argentina y es usado para el diagnóstico de la infección de HCV en pacientes atendidos en distintos Servicios Públicos de Salud. En lo que respecta a su aplicación como ensayo NAT, presenta una

sensibilidad analítica de 79 UI/reacción (527 UI/ml) [IC95%: 59,0 – 136,6 UI/reacción] determinada por

análisis de progresión probit con 20 réplicas, cuando se parte de 150 l de plasma. Bajo estas condiciones, se obtuvo un límite de detección de 5 UI/reacción (33 UI/ml). La sensibilidad clínica se evaluó en 193 muestras de plasma (101 muestras del 2010 y 93 muestras del 2011) en doble ciego procedentes del Servicio de Hemoterapia del Hospital Provincial del Centenario de la ciudad de Rosario que fueron oportunamente rechazadas para transfusión por poseer algún marcador serológico positivo o por autoexclusión.

Los resultados obtenidos (Tabla 4) muestran que de las 193 muestras analizadas con el ensayo RT-

PCR-HCV/CICHCV, 8 (4%) arrojaron resultados inválidos en el test RT-PCR-HCV/CICHCVpor presentar valores

negativos en la detección del CICHCVy, por lo tanto, fueron excluidas para el análisis de la sensibilidad

clínica. Esta situación pone de manifiesto la importancia de incluir controles de calidad de todo el

proceso, como el CICHCV, ya que permiten discriminar los resultados negativos de los resultados

falsamente negativos como fue el caso de estas 8 muestras.

Tabla 4. Análisis de la sensibilidad clínica del ensayo RT-PCR/HCV/CICHCV.

NAT

Total Detectable No detectable Inválido

Serología Reactivo 3 1 0 4

No reactivo 15 166 8 189

Total 18 167 8 193

La concordancia general entre la serología para HCV y el sistema NAT en las 185 muestras con resultados válidos fue del 91,3% (169/185). De los 18 (9,7%) individuos que arrojaron valores detectables por biología molecular según el VC, sólo 3 presentaban serología reactiva para HCV. Los individuos que presentaron resultados de anticuerpos anti-HCV No reactivos/NAT Detectable han sido citados por la Directora del Servicio de Hemoterapia para una nueva toma de muestra que permita confirmar o descartar la eventual infección en PVS por HCV. De los 167 (90,3%) individuos que arrojaron valores no detectables por biología molecular según el VC, 1 presentó serología reactiva para HCV. En efecto, la

presencia de viremia intermitente en los pacientes infectados con el HCV es frecuente y refuerza la necesidad de realizar el dosaje conjunto de anticuerpos anti-HCV y ARN viral en el tamizaje de donantes.

En conclusión, hemos podido construir un CIC específico para la detección molecular de HCV basado

en el bacteriófago Qque cumple con todas las exigencias para su uso en sistemas de detección viral con

fines diagnósticos y que constituye un requisito esencial en los ensayos NAT desarrollados in house

aplicables al tamizaje de donantes. Disponer de la capacidad de generar este reactivo permite plantear el desarrollo de sistemas NAT para otros virus transmitidos por transfusión en PVS como el HIV-1, con costos razonables y con tecnología y recursos humanos nacionales. Esta herramienta adquiriría relevancia para aumentar efectivamente la seguridad transfusional en nuestro país, y pondría a disposición una tecnología diseñada en base a las cepas que circulan en nuestra región, aspecto crítico en lo referente a la infección por HIV-1 y la situación epidemiológica planteada.