Bacterias acéticas

La identificación de BA mediante pruebas bioquímicas, morfológicas y fisiológicas se basa en los criterios que usaron previamente Visser't Hooft (1925), Asai (1968) y

Secuenciación de ADN Secuenciación de 16S rADN ARDRA Reasociación ADN-ADN RFLP-PFGE ITS-PCR tARN-PCR FISH rep-PCR RAPD’s -PCR AFLP

Frateur (1950), y han sido utilizados por varios investigadores durante los últimos

30años (Bartowsky et al., 2003; Joyeux et al., 1984; Schuller et al., 2000; Swings y De

Ley, 1981; Yamada et al., 1999). También, como en el caso de las BL, se ha utilizado el

análisis de patrones electroforéticos de proteínas totales con fines identificativos

(Kersters y De Ley, 1975, Gosselé et al., 1983; De Ley et al., 1984b). Pero la mayor

parte de los métodos moleculares de identificación utilizan el análisis de los ácidos nucleicos con diferentes aproximaciones. Se han identificado especies de BA utilizando la hibridación ADN/rADN (De Ley y Schell, 1963; Gillis y De Ley, 1980). También se ha usado la técnica RAPD’s para discriminar las distintas especies de BA del vino

(Bartowsky et al., 2003; Trĉek et al., 1997). En ocasiones se utiliza la secuenciación del

gen del ribosomal 16S ADN para diferenciar entre especies (Sievers et al., 1994b;

Sievers et al., 1996; Schuller et al., 2000). Una técnica de identificación que se basa en

las diferencias en la secuencia de este gen pero que es de más sencilla realización e interpretación es la denominada 16S-ARDRA; consiste en la amplificación el gen

ribosomal 16S y en la posterior digestión del amplificado (González et al., 2005a;

Poblet et al., 2000; Ruiz et al., 2000; Trĉek y Raspor, 1999). A veces la identidad de

secuencia entre especies es tan alta que estas técnicas impiden la correcta separación de algunas especies. En estos casos se puede recurrir al análisis de las secuencias intergénicas 16S-23S (ISR o ITS), que exhiben un mayor grado de variación que las secuencias de los genes ribosomales 16S y 23S. Ello se debe a que la mayoría de las bacterias tienen varias copias del operón ribosómico, en cada una de ellas la longitud y

la secuencia de los distintos fragmentos intergénicos pueden variar (Barry et al., 1991;

Kretova y Grones, 2005a; Navarro et al., 1992; Trĉek y Teuber, 2002). Por ello, el

análisis de los polimorfismos de los fragmentos intergénicos amplificados puede constituir por sí mismo o combinado con posterior digestión o secuenciación; una técnica útil para la discriminación a nivel de género, especie y cepa (Kretova y Grones,

2005b; Ruiz et al., 2000; Trĉek y Teuber, 2002; Yukphan et al., 2004a; Yukphan et al.,

2004b).

La secuenciación de otros genes distintos de los genes ribosomales también se ha

utilizado con fines identificativos. Así, Trĉek (2005) utilizó el análisis de una secuencia

parcial del gen de la alcohol deshidrogenasa dependiente de la quinona pirroloquinolina para la identificación de algunas especies en la que el porcentaje de similitud del gen

Introducción

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16S rADN era superior a 99% (Trĉek, 2005). En este trabajo también se recoge el

desarrollo de cebadores específicos para la detección de A. aceti. Otras técnicas de uso

común para detectar BA en distintos medios son la PCR específica y la hibridación in

situ (FISH), que pueden aplicarse a nivel de especie, género o incluso familia (Franke et

al., 2000; Franke et al., 2005; Navarro y Komagata, 1999). En los últimos años se han

aplicado nuevas técnicas como la electroforesis en gel de gradiente desnaturalizante (DGGE) para analizar las poblaciones de BA tanto en vinagre balsámico como en vino

(De Vero et al., 2006; López et al., 2003).

En ocasiones se requieren técnicas que permitan la discriminación entre cepas pertenecientes a la misma especie, algunas de las utilizadas para tipificar BA son: la distribución de quinonas respiratorias, el análisis de polimorfismos de amplificación de la región repetitiva consenso de enterobacterias (ERIC-PCR), el análisis de polimorfismos de amplificación de la región palindrómica extragénica (REP-PCR) y el

análisis de los perfiles plasmídicos (Fukaya et al., 1985; González et al., 2005;

González et al., 2004; Mariette et al., 1991; Yamada y Kondo, 1984). Esta última

técnica ha sido recientemente empleada para el análisis de cepas de Gluconobacter y

Acetobacter (Trĉek et al., 2000).

Además de su utilidad en los estudios de clasificación, la secuenciación del rARN se ha usado para desarrollar métodos rápidos de identificación bacteriana. Mediante el análisis de las secuencias parciales del rARN 16S es posible encontrar patrones de secuencias específicos para grupos, especies o incluso serotipos bacterianos. Para la identificación de los microorganismos a nivel de especie, se han desarrollado sondas específicas de la región variable del rARN 16S de tamaño entre 18-28 nucleótidos. Las diferencias en las regiones conservadas proporcionan igualmente secuencias para el diagnóstico de grupos de organismos relacionados y pueden ser usadas como dianas para el diseño de sondas a niveles taxonómicos superiores al de cepa. Sondas específicas de rARN 16S y 23S han sido aplicadas para establecer diferentes grupos y especies, así como en la identificación de bacterias. La precisión de las inferencias filogenéticas de las secuencias del rARN depende del número de bases comparadas, y para ser completamente efectivas, al menos deben ser consideradas 1000 bases para

Aunque no existe una normativa que contemple el análisis de tipo microbiológico en el proceso de elaboración de los vinos, no hay que perder de vista el que el vino es el producto de la fermentación del mosto de uva y en esta transformación intervienen gran cantidad de microorganismos. Estos microorganismos pueden ser beneficiosos, como S. cerevisiae y O. oeni, o perjudiciales como la gran mayoría de las BL y todas las BA. La adopción de medidas de control tempranas que eviten las alteraciones microbianas durante el proceso de vinificación o crianza es necesaria para obtener un vino de calidad. Por ello, el objetivo principal de este trabajo ha sido el desarrollo de una metodología rápida que permita detectar, identificar y cuantificar las BL y acéticas en el vino.

Este objetivo general se concreta en una serie de objetivos específicos, que se apuntan a continuación

1. Desarrollo de sondas fluorescentes para detección, identificación y cuantificación de especie de BL y BA del vino mediante microscopía de fluorescencia.

2. Desarrollo de cebadores específicos para detección mediante PCR específica de BA.

3. Evaluación de las técnicas desarrolladas frente al 16S-ARDRA como sistemas de identificación de BA en vino

4. Aplicación y evaluación de las técnicas anteriormente descritas (FISH, PCR específica y 16S-ARDRA) al estudio de la evolución de BA a lo largo de vinificaciones a nivel de laboratorio, planta piloto e industriales.

Objetivos