agarosa Cargar el ADN en el gel
Electroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana
H
Figura 11. Pasos de la técnica de hibridación de Southern ibridación Lavado de
la sonda Revelado
Sonda unida con la secuencia homóloga de ADN
Obtención de la sonda Marcado de la sonda
B
Cargar el ADN en el gelElectroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Lavado de la sonda Revelado
Sonda unida con la secuencia homóloga de ADN
Obtención de la sonda Marcado de la sonda
B
Cargar el ADN en el gelElectroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Lavado de la sonda Revelado
Sonda unida con la secuencia homóloga de ADN
Obtención de la sonda Marcado de la sonda
Cargar el ADN en el gel
Electroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Lavado de la sonda Revelado
Sonda unida con la secuencia homóloga de ADN Cargar el ADN en el gel
Electroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Lavado de la sonda Revelado
Cargar el ADN en el gel
Electroforesis
Migración “Southern Blot”
Transferencia del ADN a la membrana Hibridación Lavado de la sonda Revelado
Sonda unida con la secuencia homóloga de ADN
Obtención de la sonda Marcado de la sonda
B
ADN en gel de agarosa ADN en gel de agarosa Obtención de la sonda HibridaciónI.3.4. Análisis de plásmidos
Los plásmidos son moléculas de ADN extracromosómicas circulares con capacidad de replicación autónoma. Están presentes en un elevado número de bacterias y no son esenciales para el crecimiento normal de la bacteria huésped. Dado que los plásmidos portan genes metabólicos, de resistencia a antimicrobianos, de virulencia etc, pueden aportar a la bacteria huésped una ventaja para colonizar determinados ambientes. Unas veces serán ambientes defectivos en moléculas esenciales para la bacteria como aminoácidos, ácidos grasos, hierro..., pero ricos en macromoléculas (plásmidos metabólicos); otros pueden ser ambientes con sustancias antimicrobianas como antibióticos, antisépticos, metales pesados..., es el caso de los hospitales, granjas, y el propio cuerpo humano o animal cuando está sometido a tratamiento (plásmidos de resistencia a antimicrobianos); un tercer grupo lo constituyen las diferentes partes del cuerpo con diferentes ambientes y diferentes barreras biológicas y bioquímicas que tiene que evadir la bacteria para lo cual debe de poseer un arsenal de
factores de virulencia, tales como adhesinas, invasinas, sideroforos, exoenzimas, toxinas, mecanismos para evadir la fagocitosis, etc (plásmidos de virulencia) [Madigan et al., 2003].
El perfil de plásmidos vendrá dado por el número, peso molecular, así como por el patrón de restricción que nos proporcionará una información adicional de si plásmidos de semejante tamaño son o no iguales. Se trata de un método rápido, barato y sencillo, que requiere la extracción de ADN plasmídico, y cuyos pasos se recogen en la Figura 12.
Cultivo celular
Extracción del ADN plasmídico
Electroforesis
Tinción y visualización Carga del ADN Plasmídico en el gel
Cultivo celular
Extracción del ADN plasmídico
Electroforesis
Tinción y visualización Carga del ADN Plasmídico en el gel
Figura 12 . Esquema de los pasos básicos de una obtención de ADN plasmídico.
Electroforesis
Tinción y visualización Cultivo celular
Extracción del ADN plásmídico + digestión con ER
Carga del ADN en el gel
Figura 12 . Esquema de los pasos básicos de una obtención de ADN plasmídico Figura 12. Esquema de los pasos básicos en la obtención de ADN plasmídico
El ADN plasmídico, unas veces entero y otras digerido con una o varias endonucleasas de restricción, se separa en geles de agarosa y una vez teñido con bromuro de etidio se visualiza bajo luz ultravioleta. Posteriormente, se pueden localizar, en los diferentes perfiles, secuencias de ADN correspondientes a genes específicos mediante hibridación [Sambrock y Russell, 2000; Mendoza y Landeras 1999; Zhang et al., 1998; Omoe et al., 2003].
Los plásmidos se pueden mostrar en tres formas moleculares: circular superenrrollada, relajada (circular desenrollada) o abierta (lineal), y variaciones en los procedimiento de extracción o electroforesis pueden variar la proporción de las distintas formas [Sambrock y Russell, 2000]. Este hecho junto con la posibilidad de transferencia o pérdida de plásmidos, o deleción de alguno de sus genes, constituyen las desventajas que presenta esta técnica. Como método de tipificación tiene un poder de discriminación variable, en función de si la especie es portadora usual de plásmidos o no, aunque llega a ser alto si se combina con otros métodos de tipificación.
N= número total de cepas en la muestra s= número total de tipos descritos
nj= número de cepas pertenecientes al tipo j I.3.5. Análisis de datos
Las guías consenso para el uso y evaluación de los sistemas de tipificación aplicables a estudios de epidemiología microbiana han sido recopiladas [Struelens et al., 1996].
Tamaño de los plásmidos y de los fragmentos de ADN. El cálculo del tamaño de los plásmidos y fragmentos de ADN se realiza de manera aproximada: se miden las distancias, respecto del pocillo de carga, de los fragmentos obtenidos comparándolas con las de los fragmentos control. El inverso de estas distancias se representa en una gráfica frente al logaritmo en base 10 del tamaño de las bandas, y se genera una recta patrón sobre la que se interpolan las distancias de migración de las moléculas de ADN problema.
Índice de discriminación (ID). Este parámetro nos da la probabilidad de que dos cepas no relacionadas, tomadas de la población analizada, se sitúen en diferentes grupos de tipificación y viene determinado por el número de tipos definidos por el método aplicado y la frecuencia relativa de estos tipos. Se calcula por el índice de diversidad de Simpson, con la siguiente ecuación:
Determinación de los tipos genéticos y análisis filogenético.El análisis de convergencia genética entre diferentes tipos se lleva a cabo mediante la determinación del grado de similitud entre perfiles de bandas generadas por cada cepa. Cuando se hace de forma manual, no se tienen en cuenta los tamaños de las bandas que forman el perfil, se codifica la presencia o ausencia de bandas en el perfil, como 1 o 0 respectivamente. Los datos se procesan utilizando programas como el MVSP (Multivariate Statistics Package for PCs) [RockWare IncPPPPPPPP
R
PPPPPPPP
, TTTTTTTTwww.rockware.comTTTTTTTT] aplicando un
coeficiente de similitud genética, como el coeficiente de Dice (da mas valor a los fragmentos comunes o alineados) o el coeficiente de Jaccard (da mas valor a los fragmentos no alineados). El coeficiente de Dice expresa la proporción de fragmentos de ADN compartidos entre dos perfiles, y se calcula aplicando la fórmula:
El coeficiente de Jaccard expresa la proporción de fragmentos de ADN no compartidos entre dos perfiles, y se calcula aplicando la fórmula:
A partir de coeficientes de similitud, y aplicando los correspondientes algoritmos de agrupamiento, se pueden elaborar dendogramas en los que se muestra la similitud genética entre tipos. Actualmente existen equipos de lectura automática que incorporan un programa informático (software) capaz de interpretar los resultados obtenidos y realizar los correspondientes dendogramas.
F = 2nxy/(nx + ny)