Biodegradación de polietilenos por microorganismos

La resistencia del polietileno al ataque microbiano se relaciona con su elevado carácter hidrofóbico, su elevada impermeabilidad al agua, su alto peso molecular y a la ausencia de grupos funcionales que puedan ser reconocidos por los sistemas enzimáticos de los microorganismos. Se ha observado la colonización de materiales de polietileno de bajo peso molecular por hongos (Klemme, D.E. y cols. 1950) de los géneros Aspergillus,

Penicillium y Trichoderma. En el año 1950, con una mezcla de A. niger, A. flavus y P. luteum y Trichoderma sp., se llegaron a reconocer pequeños crecimientos sobre PE de

peso molecular promedio en peso de 10.000 y que no se observaron en muestras de peso molecular mayor. En un trabajo similar (Jen-Hao, L. y cols. 1961), se pudo seguir la biodegradación de un polietileno de peso molecular 17.000 empleando una suspensión bacteriana que contenía Pseudomonas aeruginosa, Brevibacterium sp. y varias especies del género Nocardia y que dio lugar a crecimientos importantes en una semana de incubación. En 1972, Potts y colaboradores (Potts, J.E. y cols. 1972) ampliaron los estudios a los polietilenos de alta y baja densidad. Para llevar a cabo el trabajo prepararon como inóculo una mezcla de los géneros A. niger, A. flavus, Chaetomium

globosum y P. funiculosum donde se pudieron percibir crecimientos similares en ambos

polímeros a pesar de la mayor cristalinidad del polietileno de alta densidad (Pm= 11.000-14-000). En los mismos tipos de polietilenos pero con pesos moleculares mayores no se apreciaron desarrollos microbianos, pero si se vieron importantes

crecimientos de estos hongos en los materiales pirolizados anaeróbicamente (Pm= 2100-

3500). El material de mayor cristalinidad (HDPE) debería mostrar menor crecimiento de hongos y, sin embargo, el crecimiento que se identificó fue muy parecido al del LDPE, polímero de menor cristalinidad y muy ramificado. Ensayos con alcanos como el dodecano (C10H22), hexadecano (C16H34) y tetracosano (C24H50) mostraron abundantes desarrollos microbianos y sus derivados metilados (2,6,11-trimetildodecano, 2,6,11,15-

18

tetrametilhexadecano y 2,6,10,15,19,23-hexametildodecano) no dieron lugar a crecimientos. El efecto de disminución de la biodegradación que producen las ramificaciones y el peso molecular se puso de manifiesto en otros trabajos de la época con alcanos de bajo peso molecular; por ejemplo, el alcano lineal de 32 carbonos (Colin, G. y cols. 1976) (C32H66, Pm= 451) donde se observaron abundantes crecimientos de microorganismos en condiciones adecuadas e incluso el de 44 carbonos (Haines, J.R. y cols. 1974) mostró ligeros crecimientos (C44H90 Pm= 620). En trabajos posteriores, de la empresa Unión Carbide, se estableció que la biodegradación se produce en los PE de peso molecular inferior a 500 Da y el hecho de observarlo en filmes de PE de peso molecular mayor se debió a las fracciones de menor tamaño en la distribución de pesos moleculares.

También en los años 70, se comprobó que la incorporación de un único grupo carbonilo en un alcano de cadena larga no tiene efecto en el desarrollo de hongos sobre el alcano. Este dato indicaría que la oxidación intrínseca del polietileno no parece influir en la biodegradación del polímero. Sin embargo los fragmentos de LDPE térmicamente degradados al aire, que por espectroscopia IR mostraron abundancia de grupos carbonilo en su estructura, se degradaron en los ensayos comentados anteriormente (tratamiento en lodos con aguas residuales y en tierra de jardín). La demanda biológica de oxígeno del ensayo con estos polietilenos, en un medio de tierra de cultivo (Jones, P.H. y cols. 1974), es aproximadamente 3 veces superior a la muestra control. A las 10 semanas, se alcanza el 9% de la demanda teórica de oxígeno. También se han llevado a cabo experimentos con cultivos enriquecidos con microorganismos procedentes de tierras de cultivo (Spencer, L.R. y cols. 1976) observándose el mismo efecto de biodegradación con los polietilenos altamente degradados. En estos trabajos se confirmó que las bacterias de los géneros Acinetobacter, Flavobacterium, Pseudomonas,

Alcaligenes, Gemella, Arthrobacter y Cellulomonas eran capaces de colonizar el

polietileno de bajo peso molecular.

En trabajos llevados a cabo en 1975, se determinó la biodegradación del polietileno comercial de baja densidad fotodegradado marcado con 14C (Albertsson, A.C. y cols. 1976, 1977, 1978a, 1978b), para ello emplearon el método de medida de 14CO2 y se puso de manifiesto la poca biodegradación a efectos prácticos que experimentaban los materiales incluso después de la fotooxidación. Los resultados pusieron de relieve que

19

el PE sin irradiar, después de 2 años de incubación en abono (“compost”) muestra una biodegradación del 0.1% y el PE irradiado, en 6 semanas de ensayo alcanza el 1%. En otros estudios se demostró (Wiles, D.M. 1973) que la presencia de especies de oxidación, hidroperóxidos y carbonilos, en la estructura del polietileno de baja densidad se localiza en la superficie del filme, ya que se producen en la degradación oxidativa que requiere la movilidad del oxígeno y, por ello, la oxidación tiene lugar fundamentalmente en la capa superficial del material (< 1 micra). Esto hace que la acción de los microorganismos sea superficial y, en consecuencia, tan lenta. Posteriormente, en 1991, se determinó por valoración de dióxido de carbono para el LDPE una mineralización de 0,35% en 2,5 años (Albertsson, A.C. y cols. 1991), mineralización prácticamente nula en comparación con su vida útil. Cuando los ensayos se llevan a cabo en suelos naturales los resultados indican que el polietileno puede tardar más de 100 años en experimentar una cierta mineralización (Ohtake, Y. y cols. 1995 y 1998). Se ha observado el proceso de biodegradación por microscopia SEM en botellas de LDPE y filmes LDPE de 60 micras enterrados en tierra de jardín en Japón. Para ello mediante el estudio de la pérdida de peso del polímero durante más de 30 años se llegó a estimar que la mineralización total de los filmes de PE es de unos 300 años. El establecimiento de ensayos adecuados de biodegradación para los materiales polímeros (Catalina, F. y cols. 2004b), es de gran importancia para la evaluación de la utilidad real de los materiales en la aplicación agrícola. Los métodos indirectos de medida del crecimiento microbiano por análisis de los productos de reacción están establecidos desde hace tiempo en diversos ensayos estándares, y la respirometría basada en la valoración del CO2 es uno de los métodos más frecuentes. El método indirecto de impedancia fue descrito por primera vez por Owens y cols. en 1989 (Owens, J.D. y cols. 1989), con el desarrollo del equipo denominado RABIT (“rapid automated bacterial impedance technique”) desarrollado por la empresa Don Whitley Sc. Ltd., del Reino Unido. Este ha sido el método empleado en este Trabajo, empleando la metodología desarrollada en trabajos anteriores (Abrusci, C. y cols. 2007b). Las condiciones de ensayo para estudiar la biodegradación del polietileno son el factor clave para interpretar los resultados obtenidos; se pueden fijar condiciones óptimas para los microorganismos, pero no se puede acelerar la biodegradación y los ensayos en polímeros son de muy larga duración (Albertsson, A.C. y cols. 1987), tal y como veremos en este Trabajo.

20

En los materiales para acolchado (Briassoulis, D., 2004) la perdida de propiedades mecánicas suele ser muy rápida ya que sus formulaciones no incorporan fotoestabilizantes. Para mejorar la biodegradación, se ha recurrido a la preparación de

mezclas de polietileno con componentes hidro-biodegradables (Kyrikou, I. y cols.

2007; Albertsson, A.C. y cols. 1993a y b) como es el caso de los filmes basados en almidón (Abrusci, C. y cols. 2008), celulosa, caucho natural, proteínas, etc., que despertaron mucho interés dentro de los plásticos biodegradables, aún incrementando el coste final de estas formulaciones entre 3 y 6 veces. Los materiales constituidos por las mezclas de almidón se desintegran fácilmente, sin embargo, el polietileno permanece en el medioambiente prácticamente inalterado.

Los denominados polímeros oxi-biodegradables (Ojeda, T.F.M. y cols. 2009; Roy, P.K. y cols. 2011b) emplean aditivos basados en compuestos poli-insaturados, iones de metales de transición y complejos metálicos que aceleran la degradación del polietileno. Los aditivos pro-oxidantes (Koutny, M. y cols. 2006) están siendo objeto de mucho interés tecnológico, económico y social, siendo frecuente ver en periódicos y otros medios de comunicación, noticias e informaciones publicitarias referentes a estos materiales. La biodegradación empieza en la superficie y debe progresar hacia el interior del material. La velocidad del proceso de biodegradación dependerá de cómo la colonización superficial se propaga a lo largo del espesor del polietileno y, por tanto, de la eficacia de los sistemas enzimáticos generados por los microorganismos en el material; al igual que en la degradación oxidativa, es fundamental la difusión del oxígeno, el agua y otras especies que catalizan la degradación (Figura I.7).

Figura I.7: Mecanismo de bio-asimilación de fragmentos de bajo peso molecular para

el PE degradado abióticamente.

Microorganismo Enzimas

1)Fragmentación del polímero. 2)Ataque enzimático superficial.

Erosión superficial Intermedios hidrófilos de bajo peso molecular Enzimas extracelulares CO2 O2- O2 H+ 2PH H2O2 POOH P HOO POO H2O Otros productos del metabolismo

21

Las grietas, rugosidades y fragmentaciones severas causadas por la biodegradación a modo de erosión superficial (Figura I.7) pueden causar hinchamiento y relajación de todo el material facilitando la difusión de agua y solubilizando productos y fragmentos en el medio que rodea la muestra. Estos resultados se han obtenido en varios trabajos (Fontanella, S. y cols. 2010) en los que se emplean diferentes condiciones y microorganismos, (Kapri, A. y cols. 2010; Konduri, M.K.R. y cols. 2011) por ejemplo, bacterias como las mencionadas anteriormente o Pseudomonas aeruginosa

(Jakubowicz, I. 2003), Arthrobacter paraffineus (Albertsson, A.C. y cols. 1995;

Albertsson, A.C. y cols. 1998), Rhodococcus ruber (Orr, I. G. y cols. 2004) o consorcios de hongos (Zahra, S. y cols. 2010; Volke-Sepulveda, T. y cols. 2002; Bonhomme, S. y cols. 2003), también en condiciones de compostaje a 50ºC (Greene, J. 2007). Los microorganismos y sus enzimas no solo interaccionan directamente con el sustrato, sino que también producen especies reactivas de oxígeno (ROS) tales como superóxidos (Morpeth, F. 1985), radicales peróxido (Shen, J. y cols. 1996), radicales hidroxilo (Tanaka, H., y cols. 1999) y radicales derivados de compuestos generados en su metabolismo (Kapich, A. N. y cols. 1999; Ruiz-Dueña, F. J. y cols. 2001) y que sirven, por su fácil difusión, de mediadoras del proceso oxidativo (Morpeth, F. 1985). También en este Trabajo, mediante medidas de quimioluminiscencia se ha podido estudiar la oxidación que producen estas especies reactivas de oxigeno, ROS, en el polietileno biodegradado, al igual se observó en gelatinas (Abrusci, C. y cols. 2004a) y triacetato de celulosa (Abrusci, C. y cols. 2009) biodegradados.

En el proceso de biodegradación, algunos autores han observado la disminución de las especies de oxidación presentes en el polietileno degradado (Reddy, M.M. y cols. 2009), hecho que puede atribuirse a la preferencia de asimilación microbiana por los esteres y compuestos carbonílicos que se forman en la degradación abiótica (Hakkarainen, M. y cols. 2004; Roy, P.K., y cols. 2011a y b; Chiellini, E. y cols. 2002; Jakubowicz, I. y cols. 2006). El mecanismo de biodegradación para los fragmentos oxidados de PE propuesto por Albertsson (Albertsson, A.C: y cols. 1987; Hakkarainen y cols. 2004) y basado en lo que ocurre en la biodegradación de parafinas se muestra en la

22 Figura I.8: Mecanismo de biodegradación del polietileno degradado abióticamente.

En la figura I.8, se muestran ambas fases de la oxi-biodegradación, abiótica y biótica, donde los fragmentos de bajo peso molecular oxidados son similares a parafinas y experimentan la biodegradación microbiana, que disminuye el número de carbonilos del material por formación de ácidos carboxílicos que reaccionan con el coenzima A (CoA) y se elimina un fragmento de dos carbonos, generando acetil-coenzima, que a su vez entra en el ciclo del ácido cítrico en el que la mineralización se produce generando dióxido de carbono y agua como productos finales. En este Trabajo la fase abiótica ha consistido en un tratamiento fotoquímico acelerado con luz artificial y en algunos casos se ha estudiado el tratamiento térmico y la degradación natural a la intemperie, en este último caso para confirmar la correlación de la degradación.

En la segunda fase del mecanismo de oxi-biodegradación, degradación biótica, es de vital importancia y así se ha hecho en este Trabajo, el aislamiento a partir del medio de aplicación del material, en nuestro caso un campo de cultivo de la Región de Murcia, y la posterior identificación de los microorganismos capaces de colonizar la superficie del filme agrícola de acolchado. Para ello se expusieron fragmentos de filmes en el campo de cultivo y después de 30 días se procedió al protocolo de aislamiento e identificación por métodos de biología molecular de las bacterias que fueron capaces de adherirse a los materiales.

Por otra parte, además de las bacterias aisladas en este Trabajo, se ha extendido el estudio empleando la bacteria Brevibacillus borstelensis, ya que en 2005 Haddad y

DEGRADACIÓN ABIÓTICA (h / / O₂ / H₂O)

Polietileno

OOH Escisión de cadenas macromoleculares CH2-C O OH CH2=CH CoASH CH2-C SCoA O O₂ H2O CH₂-CH=CH-C SCoA O

NAD+ _{NADH CoASH} H3C-C

O

SCoA

CICLO DEL ÁCIDO CÍTRICO

DEGRADACIÓN BIÓTICA (Enzimas de microorganismos)

CH2-CH CH2-C SCoA OH O CH2-C CH2-C SCoA O O CH2-C SCoA O

23

cols., demostraron que esta bacteria es capaz de utilizar el polietileno como única fuente de carbono. En 30 días a 50ºC, esta bacteria disminuyó el peso molecular de un polietileno fotodegradado un 30% y el peso del material en un 11%. B. borstelensis también fue capaz de actuar sobre el polietileno no irradiado pero en mucha menor extensión.

A lo largo de toda la Memoria se incluye la bibliografía correspondiente con numeración correlativa. También se ha optado por la nomenclatura IUPAC de los productos y el empleo de códigos para designar los productos objeto de estudio. Asimismo, para los polímeros empleados se han utilizado los acrónimos internacionales en inglés.

Con la finalidad de lograr una claridad suficiente a la hora de exponer el Trabajo realizado, el contenido de esta Memoria se ha estructurado en Capítulos, de los que el primero de ellos se corresponde con los antecedentes relativos al campo de estudio. En el segundo Capítulo se describirán los Objetivos concretos planteados en esta Tesis; en el Capítulo tercero se describirán los Materiales utilizados y las Técnicas instrumentales

y Metodologías empleadas para llevar a cabo todas las medidas experimentales. El

Capítulo cuarto es el correspondiente a Resultados, que está dividido en los apartados de Aislamiento bacteriano, degradación abiótica: fotoquímica y térmica de filmes de polietileno y de copolímeros etileno-acetato de vinilo (EVA) con estearatos de Ca, Fe, Co y Mn como aditivos pro-oxidantes, así como, el estudio de la biodegradación microbiológica de polietilenos, que incluye el estudio de la formación de biofilmes, bioasimilación de productos de bajo peso molecular y mineralización por determinación de dióxido de carbono por medidas indirectas de impedancia.

El Capitulo quinto, recoge la Discusión de los resultados obtenidos en los apartados mencionados anteriormente. Por último, en el capítulo sexto, se resumen las

Conclusiones más relevantes del Trabajo.

Se concluye con el listado de Referencias en orden alfabético de primer autor y dos Anexos. En el Anexo I se recoge la información reseñada en el capítulo de Resultados como información adicional. En el Anexo II se incluyen las tres publicaciones SCI que

24

este Trabajo ha dado lugar hasta la fecha, aunque los resultados con los pro-oxidantes de cobalto y manganeso están pendientes de publicación.