Se siguió el mismo procedimiento pero sin el agregado de la solución Standard.
e) Procedimiento a seguir con la Muestra Exame n::
A 0.1 g de cenizas de la muestra se añadió 5 mL de HCl cc y evaporó a sequedad en baño María. Se agregó al residuo obtenido 2 ml de HCl cc, se calentó por 5 min sobre una luna de reloj, se pasó por filtración a una fiola de 100 mL y aforó con agua destilada.
Se tomó con pipeta 2 mL del aforo anterior, y se agregó 1 mL de solución de clorhidrato de hidroxilamina y se dejó en reposo 5 min. Luego se añadió 5 mL de solución de buffer de acetato, 1 mL de solución de fenantrolina, y aforó a 25 mL con agua destilada. Se homogenizó y efectuó la lectura a 540 nm, con la cual se consultó la curva. (Anexo 12)
8.3. DOSAJE DE FÓSFORO:
Método de Fiske y Subbarow 26:
Fundame nto: Se basa en el desarrollo de una coloración azul por formación de un compuesto fosfomolibdoso por reducción selectiva del fosfomolibdato bajo la acción del ácido aminonaftosulfónico. La coloración obtenida es utilizada para la valoración fotocolorimétrica por comparación con una solución Standard de fósforo. La lectura se realiza a 660 nm.
BIBLIOTECA
DE FARMACIA
Y BIOQUIMICA
Procedimiento:a) Solución patrón de fósforo: 0.4 g de KH2PO4 (fosfato
monopotásico puro), se colocó en una fiola de 1000 mL, agregó una pequeña cantidad de agua destilada para disolver y se aforó.
1 mL de la solución…………...0.1 mg de Fósforo
b) Preparación de los Standard:
- Standard N° 1: Se midió 2 mL de la solución patrón y aforó a 50 mL con ácido Tricloroacético al 5%.
1 mL de la solución………..0.004 mg P.
- Standard N° 2: se midió 4 mL de la solución patrón y aforó a 50 mL con ácido Tricloroacético al 5%.
1 mL de la solución………..0.008 mg P.
- Standard N° 3: Se midió 6 mL de la solución patrón y aforó a 50 mL con ácido Tricloroacético al 5%.
1 mL de la solución………..0.012 mg P.
- Standard N° 4: Se midió 8 mL de la solución patrón y aforó a 50 mL con ácido Tricloroacético al 5%.
c) Obtención de la curva:
De cada uno de los Standard preparados anteriormente, se tomó 5 mL y colocó en cuatro fiolas de 25 mL. Luego a cada una de ellas se agregó 1 mL de solución de molibdato de amonio, 0.4 mL de solución de ácido aminonaftosulfónico, se mezcló y aforó con agua destilada y se volvió a mezclar. Se dejó en reposo 10 min y se hicieron las lecturas, con cuyos datos se trazó la curva.
BIBLIOTECA
DE FARMACIA
Y BIOQUIMICA
d) Preparación del blanco:Se siguió el mismo procedimiento pero sin el agregado de la solución Standard.
e) Procedimiento a seguir con la Muestra Exame n:
- En una fiola de 100 mL se colocaron: 0.1 g de cenizas y c.s.p. 100
mL de ácido Tricloroacético al 5%. Se mezcló mediante agitación enérgica y filtró a través de un papel de filtro fino. El filtrado fue claro transparente.
- Se colocó en una fiola de 25 mL: 1 mL del filtrado obtenido
anteriormente, 1 mL de solución de molibdato de amonio y 0.4 mL de solución del ácido aminonaftolsulfónico. Se mezcló y aforó a 25 mL con agua destilada, se volvió a mezclar, se dejó en reposo 10 minutos. Luego se procedió a efectuar la lectura, con la cual se consultó la curva. (Anexo 13)
9.2. CUANTIFICACIÓN DE VITAMINA C:
Método de Tillmans modificado por Bessey y King27:
Fundame nto: Este método se basa en la reducción del 2,6 diclorofenolindofenol por el ácido ascórbico.
Procedimiento:
Extracción de clorofila: En un vaso de licuadora que contenía 15 mL de ácido Metafosfórico, se agregó 5 g de hojas frescas picadas de la muestra fresca, se licuó hasta la obtención de una mezcla homogénea, filtró con algodón, obteniendo una solución acuosa ácida, se llevó a
BIBLIOTECA
DE FARMACIA
Y BIOQUIMICA
una pera de decantación y agregó c. s. (15 ml) de Éter de petróleo (bencina), se recibió el extracto acuoso ácido en un vaso de precipitación, se eliminó la fase etérea. Se repitió el procedimiento nuevamente. Esta solución ácida obtenida sirvió para la cuantificación de vitamina C, ya que la clorofila puede interferir en los resultados. Luego se prepararon las siguientes soluciones:
Solución estabilizadora de ácido metafosfórico al 3%.
Solución patrón o estándar de ácido ascórbico: Se disolvió 20 mg de Ácido Ascórbico en c.s. de solución de ácido metafosfórico al 3% para 100 mL. Se mezcló.
Solución de 2,6- Diclorofenolindofenol: Se preparó disolviendo 50 mg del reactivo puro en 100 mL de agua destilada caliente. Se filtró.
Solución proble ma: Se tomó 5 mL de la solución acuosa ácida libre de clorofila, obtenida anteriormente y aforó a 50 mL.
Titulación de la solución standard o patrón: En un vaso de precipitación se colocó 4 mL de la solución patrón que equivale a 0.8 mg de Ácido Ascórbico. Se tituló utilizando una pipeta de 1 mL en la que se colocó la solución de 2,6-diclorofenolindofenol y se dejó caer gota a gota hasta la aparición de un color rosa pálido que persistió por lo menos 30 segundos. Se anotó los mL gastados.
Titulación de la solución problema: Se siguió el mismo procedimiento que para el patrón con la sola diferencia que se midieron 5 mL de la solución problema. Se anotó los mL gastados.
BIBLIOTECA
DE FARMACIA
Y BIOQUIMICA
Titulación de la solución blanco: En un vaso de precipitación se colocó 4 mL de la solución de ácido metafosfórico 3 % y se tituló igual que la solución patrón y problema. Se anotó los mL gastados.
Cálculos:
GASTO PATRON – GASTO BLANCO= S mL
GASTO PROBLEMA – GASTO BLANCO= P mL
Si
S mL--- 0.8 mg ácido ascórbico
P mL --- X mg ácido ascórbico
El resultado obtenido es la cantidad de ácido ascórbico que hay en 5 mL de solución problema. Luego se expresó en porcentaje.
9.3. IDENTIFICACIÓN DE VITAMINAS HIDROSOLUBLES :
Extracción de la clorofila: 10 g de muestra, se lavó y licuó con c. s. (20 mL) de agua destilada; luego se procedió a filtrar. Se colocó 5 mL del filtrado obtenido en una cápsula de porcelana y se llevó a sequedad a fuego directo sobre cocina eléctrica, cuidando de que no se queme la muestra. Se retiró del fuego la cápsula de porcelana y a la materia seca obtenida se le agregó bencina (con el fin de eliminar la clorofila), se agitó un momento, se desechó la bencina y se repitió esto varias veces hasta la obtención de un color verde amarillento claro. La materia seca obtenida libre de clorofila nos sirvió para la identificación de las vitaminas hidrosolubles.