6. Materiales y Métodos.
7.6 En células tumorales las toxinas Cry promueven la muerte celular programada.
En base a los datos obtenidos en los ensayos de MTT (3-(4,5- dimetiltiazol- 2-ilo)-2,5-difeniltetrazol) se evaluó si las células tratadas con las toxinas Cry sufren un proceso de muerte celular programada (apoptosis) o algún otro proceso como lísis celular. Las características principales observadas en el proceso de apoptosis son la condensación de núcleos y la fragmentación del DNA. Para evaluar si las células tumorales, en presencia de la toxina, sufren estos procesos se realizaron los ensayos de escaleras de DNA, para determinar la fragmentación, y el de tinción de núcleos con DAPI para analizar la condensación (Fig.14 a,c).
Los resultados determinaron lo ya especulado, las células tumorales (MDA- 231) presentaron muerte celular programada al estar expuestas a las toxinas Cry manifestando tanto condensación de núcleos como fragmentación de DNA. Estos procesos de muerte no se observaron en las células no transformadas (HaCat) en presencia de toxina. Para confirmar estos resultados se realizó el ensayo de cometa para evaluar la capacidad de migrar el DNA fragmentado en comparación a la incapacidad de hacerlo en células que el DNA aun conserva su estructura de súper enrollamiento (Fig.14b) Estos ensayos confirmaron y sustentaron los datos ya mostrados, donde especulamos que las toxinas Cry inactivan la vía de PI3K/Akt desencadenando una respuesta de muerte celular programada.
A)
B)
X
Fig.14 Las toxinas Cry inducen la muerte celular programada.
Se analizó la capacidad de las toxinas Cry para inducir muerte celular programada a través de la inhibición de la vía PI3K/Akt. A) Las células se tiñeron con CAPII para observar la condensación de la cromatina. B) Se realizó el ensayo de cometa para evaluar la fragmentación del DNA. C) Mediante una cinética de tiempos se analizó la fragmentación del DNA mediante la técnica de escaleras de DNA, esto en un gel de agarosa al 2%.
C)
X X
8. Discusión.
En base a los experimentos realizados y a la literatura citada podemos argumentar que la inactivación de la vía PI3K/Akt es el mecanismo molecular que las toxinas Cry analizadas están utilizando preferencialmente al inducir muerte celular en células tumorales.
Como se planteó en un principio la vía de señalización PI3K/Akt juega un papel crucial en el control de ciclo celular, por ende en la proliferación celular, por lo que su regulación negativa se ha asociado de manera directa a la activación del mecanismo de muerte celular programada (Franke et al. 2008a). En células cancerígenas la regulación positiva de esta vía de señalización se ha relacionado recientemente con la activación de ciertos receptores de adhesión celular, como es el caso de las caderinas, y a diversos receptores de factores de crecimiento, consecuentemente la expresión y presencia en membrana de estos receptores es crucial para la activación de la vía (L. Larue and A. Bellacosa 2010). En el caso de la expresión de las caderinas es un modelo muy estudiado en células tumorales, en donde se ha reportado que dependiendo de la línea celular así como su nivel de confluencia la expresión de estos receptores puede fluctuar. La expresión de la caderina-11 se ha relacionado directamente con la capacidad de migrar y de formar metástasis, así como en ciertas condiciones inducir proliferación, por lo que su expresión se asocia como un mal pronóstico. De forma contraria, a la caderina-E se le ha atribuido un perfil de gen supresor de tumores, el cual se ha reportado que es capaz de inhibir la migración celular y de manera directa induce la expresión de PTEN, el inhibidor natural de Akt (L. Larue and A. Bellacosa 2010). Conforme a estos antecedentes la expresión de caderinas en cáncer es de vital importancia ya que de esta forma las células controlan diversos
procesos durante el desarrollo celular. Por lo tanto dichos receptores se han convertido en blancos moleculares de posibles terapias contra cáncer. En base a los resultados obtenidos en células de cáncer de mama (MDA- 231), en donde las toxinas presentan mayor actividad, el mecanismo de acción que estas están siguiendo se podría resumir a su interacción con el receptor de adhesión caderina-11 y al bloqueo de la vía PI3K/Akt.
En este modelo las toxinas interactúan preferencialmente con el receptor de adhesión celular caderina-11 permitiendo de esta manera bloquear la señalización celular emitida por la vía PI3K/Akt, reprimiendo de esta forma la expresión de genes involucrados en proliferación celular como c-Myc y Ciclina D1, lo que conlleva a la regulación positiva de señales apoptoticas (Fig.15). Sin embargo, la señalización celular no es el único mecanismo de acción por el cual las toxinas pudieran estar induciendo muerte en células tumorales, estas al interaccionar con el receptor de adhesión celular podrían inducir la formación de un poro en membrana lo que provocaría la lisis y la muerte celular manifestada. La interacción con algún otro receptor de membrana se podría estar dando pero en mucho menor medida ya que la especificidad observada es muy baja pero no nula, en estos casos la concentración de toxina utilizada tendría que ser mucho mayor. Cabe mencionar que estos dos mecanismos de señalización y lisis celular podrían también estar actuando de manera sinérgica y no ser excluyentes uno del otro.
En base a toda esta información podemos inferir que las toxinas Cry de
Bacillus Thuringiensis presentan actividad anticancerígena interactuando
con un receptor de adhesión celular en membrana permitiendo de esta forma tanto la inactivación de la vía de señalización PI3K/Akt como la formación de un poro en membrana que conlleva a la lisis celular. Esta regulación celular permite inhibir tanto la proliferación como la migración celular, esto al inducir muerte celular programada.
Sin embargo, aunque se conocen los mecanismos moleculares que las toxinas desempeñan, aun se desconocen los genes que estas toxinas están regulando transcripciónalmente, ya sea positiva o negativamente, lo que nos permitiría contar la historia completa del mecanismo de acción de las toxinas Cry en células tumorales.
Fig.15 Mecanismo de acción.
En este modelo el receptor de adhesión celular reconoce a las toxinas e induce el bloqueo de la vía de señalización PI3K/Akt induciendo de esta forma la degradación del factor de transcripción -catenina así como el bloqueo de la expresión de los oncogenes c-Myc y
9. Conclusiones.
• En células de cáncer de mama (MDA-231) las toxinas Cry
presentaron una mayor actividad citotoxica.
• Las toxinas Cry presentaron una mayor afinidad al interaccionar con
el receptor de adhesión celular caderina-11.
• Las toxinas Cry en células tumorales MDA-231 inhiben la vía de
PI3K/Akt.
• Las proteínas parasporales Cry inhiben tanto la proliferación como la
migración celular a través del bloqueo de la vía de señalización PI3K/Akt.
10. Perspectivas.
• Determinar los genes regulados tanto positivamente como negativamente
por las toxinas Cry al inhibir la vía de señalización PI3K/Akt.
• Descifrar los dominios específicos de interacción entre la toxina y el
receptor.
• Realizar los ensayos de actividad citotoxica in vivo en modelos de ratones
desnudos.
• Realizar un RNAi contra la caderina-11 con la finalidad de sensar su
capacidad de interacción con las toxinas Cry. Estos ensayos se realizarían tanto in vitro como in vivo.
• Evaluar la capacidad citotoxica de las toxinas Cry por separado, en el caso
del consorcio, o en diferentes combinaciones entre ellas, con la finalidad de evaluar cual de ellas pudiera presentar una mayor actividad.
Referencias Bibliográficas.
• Abe, Y., Shimada, H. and Kitada, S. 2008. Raft-targeting and
oligomerization of Parasporin-2, a Bacillus thuringiensis crystal protein with anti-tumour activity. J. Biochem 143(2): 269-275.
• Arboleda, M.J., Lyons, J.F., Kabbinavar, F.F., Bray, M.R., Snow, B.E.,
Ayala, R., Danino, M., Karlan, B.Y., and Slamon, D.J. 2003. Overexpression of AKT2/protein kinase Bbeta leads to up-regulation of beta1 integrins, increased invasion, and metastasis of human breast and ovarian cancer cells. Cancer Res 63(1): 196-206.
• Arias Bañuelos Efraín 2011. Identificación y caracterización de genes y
proteínas CRY de Bacillus thuringiensis con actividad citotóxica hacia células de cáncer humano. Tesis de maestría CICESE.
• Barna, M., Pusic, A., Zollo, O., Costa, M., Kondrashov, N., Rego, E., Rao,
P.H., and Ruggero, D. 2008. Suppression of Myc oncogenic activity by ribosomal protein haploinsufficiency. Nature 456(7224): 971-975.
• Bellacosa A. and Larue L. 2010. PI3K/AKT Pathway and the Epithelial–
Mesenchymal Transition. Cancer Genome and Tumor Microenvironment,
chapter 2: 11-32.
• Bertini, E., Oka, T., Sudol, M., Strano, S., and Blandino, G. 2009. YAP: at
the crossroad between transformation and tumor suppression. Cell Cycle 8(1): 49-57.
• Blandino, G., Shaul, Y., Strano, S., Sudol, M., and Yaffe, M. 2009. The
Hippo tumor suppressor pathway: a brainstorming workshop. Sci Signal 2(95): mr6.
• Bowman, T., Broome, M.A., Sinibaldi, D., Wharton, W., Pledger, W.J.,
Sedivy, J.M., Irby, R., Yeatman, T., Courtneidge, S.A., and Jove, R. 2001. Stat3-mediated Myc expression is required for Src transformation and PDGF-induced mitogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A 98(13): 7319-7324.
• Bravo Alejandra., Gill Sarjeet S., and Mario Soberón Mario 2004. Mode of
action of Bacillus thuringiensis Cry and Cyt toxins and their potential for insect control. Toxicon 49(4): 423–435.
• Burgering, B.M. and Coffer, P.J. 1995. Protein kinase B (c-Akt) in
phosphatidylinositol-3-OH kinase signal transduction. Nature 376(6541): 599-602.
• Carlsson, S.R. and Fukuda, M. 1986. Isolation and characterization of
leukosialin, a major sialoglycoprotein on human leukocytes. J Biol Chem 261(27): 12779-12786.
• Cheng, J.Q., Ruggeri, B., Klein, W.M., Sonoda, G., Altomare, D.A., Watson,
D.K., and Testa, J.R. 1996. Amplification of AKT2 in human pancreatic cells and inhibition of AKT2 expression and tumorigenicity by antisense RNA. Proc Natl Acad Sci U S A 93(8): 3636-3641.
• Dbouk HA, Vadas O, Shymanets A, Burke JE, Salamon RS, Khalil BD,
Barrett MO, Waldo GL, Surve C, Hsueh C, Perisic O, Harteneck C, Shepherd PR, Harden TK, Smrcka AV, Taussig R, Bresnick AR, Nürnberg B, Williams RL, Backer JM. 2012. G Protein–Coupled Receptor–Mediated Activationof p110b by Gbg Is Required for Cellular Transformation and Invasiveness. Science Signaling 5 (253): 1937-9145.
• Franke, T.F. 2008a. Intracellular signaling by Akt: bound to be specific. Sci
Signal 1(24): pe29.
• Franke, T.F. 2008b. PI3K/Akt: getting it right matters. Oncogene 27(50):
6473-6488.
• Freeman, D.J., Li, A.G., Wei, G., Li, H.H., Kertesz, N., Lesche, R., Whale,
A.D., Martinez-Diaz, H., Rozengurt, N., Cardiff, R.D. et al. 2003. PTEN tumor suppressor regulates p53 protein levels and activity through phosphatase-dependent and -independent mechanisms. Cancer Cell 3(2): 117-130.
• Fukuda, M. and Carlsson, S.R. 1986. Leukosialin, a major sialoglycoprotein
on human leukocytes as differentiation antigens. Med Biol 64(6): 335-343.
• Gabrilovac Jelka, Čupić Barbara, Breljak Davorka, Zekušić Marija, Boranić
Milivoj 2003. Expression of CD13/aminopeptidase N and CD10/neutral endopeptidase on cultured human keratinocytes. Immunology Letters 91(1): 39-47.
• Golias, C.H., Charalabopoulos, A., and Charalabopoulos, K. 2004. Cell
proliferation and cell cycle control: a mini review. Int J Clin Pract 58(12): 1134-1141.
• Gordon R.E., Haynes W.C., Hor-Nay Pang C. 1973. The genus Bacillus.
USDA handbook, 427. Washington, D.C.
• Hanahan, D. and Weinberg, R.A. 2000. The hallmarks of cancer. Cell
100(1): 57-70.
• Harvey, K. and Tapon, N. 2007. The Salvador-Warts-Hippo pathway - an
emerging tumour-suppressor network. Nat Rev Cancer 7(3): 182-191.
• Hay, B.A. and Guo, M. 2003. Coupling cell growth, proliferation, and death.
Hippo weighs in. Dev Cell 5(3): 361-363.
• Khetan SH 2001. Bacterial insecticides, Part 1. Marcel Decker,
Massachusetts USA, 99. 3-71.
• Kim Nam-Gyun, Koh Eunjin, Chen Xiao, and M. Gumbiner Barry 2011. E-
cadherin mediates contact inhibition of proliferation through Hippo signaling- pathway components. PNAS 108 (29): 11930–11935.
• Lin, H.K., Wang, G., Chen, Z., Teruya-Feldstein, J., Liu, Y., Chan, C.H.,
Yang, W.L., Erdjument-Bromage, H., Nakayama, K.I., Nimer, S. et al. 2009. Phosphorylation-dependent regulation of cytosolic localization and oncogenic function of Skp2 by Akt/PKB. Nat Cell Biol 11(4): 420-432.
• Lopez-Meza Joel E. and Ibarra Jorge E. 1996. Characterization of a Novel
Strain of Bacillus thuringiensis. Applied and Environmental Microbiology 62(4): 1306–1310.
• Maemura, K. and Fukuda, M. 1992. Poly-N-acetyllactosaminyl O-glycans
attached to leukosialin. The presence of sialyl Le(x) structures in O-glycans.
J Biol Chem 267(34): 24379-24386.
• Malumbres, M. and Barbacid, M. 2009. Cell cycle, CDKs and cancer: a
changing paradigm. Nat Rev Cancer 9(3): 153-166.
• Malumbres, M., Harlow, E., Hunt, T., Hunter, T., Lahti, J.M., Manning, G.,
Morgan, D.O., Tsai, L.H., and Wolgemuth, D.J. 2009. Cyclin-dependent kinases: a family portrait. Nat Cell Biol 11(11): 1275-1276.
• Marianne Pusztai., Paul Fast., Larry Gringorten., Harvey Kaplan,: Timothy
Lessard and Paul R. Carey 1991. The mechanism of sunlight-mediated inactivation of Bacillus thuringiensis crystals. Biochem J. 273(1): 43-47.
• McClatchey, A.I. 2003. Merlin and ERM proteins: unappreciated roles in
cancer development? Nat Rev Cancer 3(11): 877-883.
• McFarland, T.A., Ardman, B., Manjunath, N., Fabry, J.A., and Lieberman, J.
Moon, N.S., Di Stefano, L., Morris, E.J., Patel, R., White, K., and Dyson, N.J. 2008. E2F and p53 induce apoptosis independently during Drosophila development but intersect in the context of DNA damage. PLoS Genet 4(8): 1-10.
• Mendoza Almaza Gretel 2011. Aislamiento y caracterización de las toxinas
CRY de Bacillus Thuringiensis con actividad citócida sobre células de cáncer cervicouterino in vitro e in vivo. Tesis de doctorado CICESE.
• Morris, E.J., Ji, J.Y., Yang, F., Di Stefano, L., Herr, A., Moon, N.S., Kwon,
E.J., Haigis, K.M., Naar, A.M., and Dyson, N.J. 2008. E2F1 represses beta- catenin transcription and is antagonized by both pRB and CDK8. Nature 455(7212): 552-556.
• Morrison, H., Sherman, L.S., Legg, J., Banine, F., Isacke, C., Haipek, C.A.,
Gutmann, D.H., Ponta, H., and Herrlich, P. 2001. The NF2 tumor suppressor gene product, merlin, mediates contact inhibition of growth
• Nachimuthu Saraswathy., Polumetla Ananda Kumar 2004. Protein
engineering of d-endotoxins of Bacillus thuringiensis. Electronic Journal of Biotechnology 7(2): 2311-2317.
• Nieman MT, Prudoff RS, Johnson KR, Wheelock MJ 1999. N-Cadherin
Promotes Motility in Human Breast Cancer Cells Regardless of their E- Cadherin Expression. The Journal of Cell Biology 147(3): 631-643.
• Nuria Jiménez-Juárez Nuria, Muñoz-Garay Carlos, Gómez Isabel, Saab-
Rincon Gloria, Y. Juanita, Almazo-Damian, Gill Sarjeet S., Mario Soberón Mario, and Bravo Alejandra 2007. Bacillus thuringiensis Cry1Ab Mutants Affecting Oligomer Formation Are Non-toxic to Manduca sexta Larvae. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology 282 (29): 21222– 21229.
• Nusse, R. 2005. Wnt signaling in disease and in development. Cell Res
15(1): 28-32.
• Okada, M., Wang, Y., Jang, S.W., Tang, X., Neri, L.M., and Ye, K. 2009. Akt
phosphorylation of merlin enhances its binding to phosphatidylinositols and inhibits the tumor-suppressive activities of merlin. Cancer Res 69(9): 4043- 4051.
• Olmos Soto Jorge, Arias Bañuelos Efraín, Mendoza Almaza Gretel 2012.
Proteínas CRY insecticidas de Bacillus Thuringiensis con actividad anticancerígena. PCT (solicitud de patente), número de publicación internacional: W0 2012/080985 A2.
• Pang, S.T., Fang, X., Valdman, A., Norstedt, G., Pousette, A., Egevad, L.,
and Ekman, P. 2004. Expression of ezrin in prostatic intraepithelial neoplasia. Urology 63(3): 609-612.
• Porta Helena, Cancino-Rodezno Angeles, Soberón Mario, Bravo Alejandra
2010. Role of MAPK p38 in the cellular responses to pore-forming toxins. Peptides 32 (3): 601–606.
• Rajamohan Francis, Alzate Oscar, A. Cotrill Jeffrey, Curtiss April, and H.
Dean Donald 1996. Protein engineering of Bacillus thuringiensis endotoxin: Mutations at domain II of CryIAb enhance receptor affinity and toxicity toward gypsy moth larvae. Applied Biological Sciences 93 (25):14338– 14343.
• Ren, L., Hong, S.H., Cassavaugh, J., Osborne, T., Chou, A.J., Kim, S.Y.,
Gorlick, R., Hewitt, S.M., and Khanna, C. 2009. The actin-cytoskeleton linker protein ezrin is regulated during osteosarcoma metastasis by PKC. Oncogene 28(6): 792-802.
• Rossig, L., Jadidi, A.S., Urbich, C., Badorff, C., Zeiher, A.M., and Dimmeler,
S. 2001. Akt-dependent phosphorylation of p21(Cip1) regulates PCNA binding and proliferation of endothelial cells. Mol Cell Biol 21(16): 5644- 5657.
• Rouleau, G.A., Merel, P., Lutchman, M., Sanson, M., Zucman, J., Marineau,
C., Hoang-Xuan, K., Demczuk, S., Desmaze, C., Plougastel, B. et al. 1993. Alteration in a new gene encoding a putative membrane-organizing protein causes neuro-fibromatosis type 2. Nature 363(6429): 515-521.
• Ryoo, H.D. and Steller, H. 2003. Hippo and its mission for growth control.
Nat Cell Biol 5(10): 853-855.
• Santra, M.K., Wajapeyee, N., and Green, M.R. 2009. F-box protein FBXO31
mediates cyclin D1 degradation to induce G1 arrest after DNA damage. Nature 459(7247): 722-725.
• Saitoh, H., Okumura, S., Ishikawa, T., Akao, T., Mizuki, E. and Ohba, M.
2006. Investigation of a novel Bacillus thuringiensis gene encoding a parasporal protein, parasporin-4, that preferentially kills leukaemic T cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 70(20): 2935-2941.
• Satyanarayana, A. and Kaldis, P. 2009. Mammalian cell-cycle regulation:
• Schnepf E., Crickmore N., Van rie J., Lereclus D., Baum J., Feitelson J.,
Zeigler D. R., Dean D. H. 1998. Bacillus thuringiensis and Its Pesticidal Crystal Proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, 62(3): 775– 806.
• Stelma GN, Jr, Aronson AI, Fitz-James PC 1980. A Bacillus cereus mutant
defective in spore coat deposition. J Gen Microbiol. 116(1):173–185.
• Suzuki, J. and Shishido, T. 2007. Regulation of cellular transformation by
oncogenic and normal Abl kinases. J Biochem 141(4): 453-458.
• Takeshi Yagi and Masatoshi Takeichi 2000.Cadherin superfamily genes:
functions, genomic organization, and neurologic diversity. Genes Dev. 14: 1169-1180.
• Tang, X., Jang, S.W., Wang, X., Liu, Z., Bahr, S.M., Sun, S.Y., Brat, D.,
Gutmann, D.H., and Ye, K. 2007. Akt phosphorylation regulates the tumour- suppressor merlin through ubiquitination and degradation. Nat Cell Biol
9(10): 1199-1207.
• Van Maerken, T., Vandesompele, J., Rihani, A., De Paepe, A., and
Speleman, F. 2009. Escape from p53-mediated tumor surveillance in neuroblastoma: switching off the p14(ARF)-MDM2-p53 axis. Cell Death Differ 16(12): 1563-1572.
• Weng, W.H., Ahlen, J., Astrom, K., Lui, W.O., and Larsson, C. 2005.
Prognostic impact of immunohistochemical expression of ezrin in highly malignant soft tissue sarcomas. Clin Cancer Res 11(17): 6198-6204.
• Whibley, C., Pharoah, P.D., and Hollstein, M. 2009. p53 polymorphisms:
cancer implications. Nat Rev Cancer 9(2): 95-107.
• Whitfield, M.L., George, L.K., Grant, G.D., and Perou, C.M. 2006. Common
• Witze, E.S., Litman, E.S., Argast, G.M., Moon, R.T., and Ahn, N.G. 2008.
Wnt5a control of cell polarity and directional movement by polarized redistribution of adhesion receptors. Science 320(5874): 365-369.
•
Wong Alice S.T. and Gumbiner Barry M. 2003. Adhesion-independent mechanism for suppression of tumor cell invasion by E-cadherin. The Journal of Cell Biology, Volume 161, (6): 1191–1203.• Wu, K.L., Khan, S., Lakhe-Reddy, S., Jarad, G., Mukherjee, A., Obejero-
Paz, C.A., Konieczkowski, M., Sedor, J.R., and Schelling, J.R. 2004. The NHE1 Na+/H+ exchanger recruits ezrin/radixin/moesin proteins to regulate Akt-dependent cell survival. J Biol Chem 279(25): 26280-26286.
• Yu, H., Pardoll, D., and Jove, R. 2009. STATs in cancer inflammation and
immunity: a leading role for STAT3. Nat Rev Cancer 9(11): 798-809.
• Zeller, K.I., Zhao, X., Lee, C.W., Chiu, K.P., Yao, F., Yustein, J.T., Ooi,
H.S., Orlov, Y.L., Shahab, A., Yong, H.C. et al. 2006. Global mapping of c- Myc binding sites and target gene networks in human B cells. Proc Natl Acad Sci U S A 103(47): 17834-17839.
• Zha, J., Harada, H., Yang, E., Jockel, J., and Korsmeyer, S.J. 1996. Serine
phosphorylation of death agonist BAD in response to survival factor results in binding to 14-3-3 not BCL-X(L). Cell 87(4): 619-628.
• Zhang X, Candas M, Griko NB, Taussig R, Bulla LA Jr. 2006. A mechanism
of cell death involving an adenylyl cyclase/PKA signaling pathway is
induced by the Cry1Ab toxin of Bacillus thuringiensis.PNAS 103 (26): 9897-
9902.
• Zhao, B., Lei, Q.Y., and Guan, K.L. 2008. The Hippo-YAP pathway: new
connections between regulation of organ size and cancer. Curr Opin Cell Biol 20(6): 638-646.
• Zhao, B., Wei, X., Li, W., Udan, R.S., Yang, Q., Kim, J., Xie, J., Ikenoue, T.,
Yu, J., Li, L. et al. 2007. Inactivation of YAP oncoprotein by the Hippo pathway is involved in cell contact inhibition and tissue growth control.
12. ANEXOS