Un método apropiado para la preparación de la muestra es absolutamente esencial para obtener buenos resultados en la electroforesis bidimensional. Debido a la gran diversidad de muestras, sólo pueden darse unas líneas generales para la preparación de la muestra. El procedimiento óptimo debe ser determinado empíricamente para cada muestra. Idealmente el proceso de preparación de la muestra debe resultar en una completa solubilización, disgregación, desnaturalización y reducción de las proteínas en la muestra para romper todas las interacciones moleculares y asegurarse de que cada punto representa a un polipéptido individual [34]. La preparación de la muestra debe ser tan simple como sea posible para incrementar la reproducibilidad, de hecho un solo paso de preparación de muestra sería altamente deseable. La solubilización de la muestra se realiza normalmente con una tampón que contiene agentes caótropos (urea y/o tiourea), detergentes no-iónicos o zwitteriónicos (CHAPS, Tritón X-100, etc.), agentes reductores (DTT, TBP), anfolitos e inhibidores de proteasas, dependiendo de la muestra.
Agentes caótropos:
La urea es eficiente rompiendo puentes de hidrógeno, llevando a la proteína a desplegarse y desnaturalizarse. La tiourea, introducida por Rabilloud [35] es mejor rompiendo interacciones hidrofóbicas, pero su uso viene limitado por su pobre solubilidad en agua, aunque es más
proteínas hidrofóbicas es una combinación de 5-7 M urea y 2 M tiourea, conjuntamente con los detergentes apropiados [36].
Detergentes:
Los detergentes son utilizados para prevenir las interacciones hidrofóbicas entre dominios hidrofóbicos de proteínas y evitar la pérdida de proteína debido a la agregación y/o precipitación. Además, permiten solubilizar proteínas asociadas a la membrana.
El detergente iónico SDS es uno de los más eficientes solubilizadores de proteínas. La solubilización de proteínas con 1% SDS (hirviendo) es un método recomendado, pero conlleva un grave problema. Al ser un detergente iónico, éste proporciona carga a las proteínas con lo que modifica el punto isoeléctrico de las mismas. Para evitar esto basta con diluir el SDS por debajo de una concentración crítica (0.2%) con otros detergentes no-iónicos [37]. Los detergentes no-iónicos más populares son el NP-40, Tritón X-100 y el dodecil maltósido. Los dos primeros no son demasiado buenos solubilizando proteínas de membrana. Para la solubilización de proteínas de membrana, detergentes zwitteriónicos como el CHAPS y las sulfobetaínas (SB 3-10, ASB-14) son mucho más efectivos [38]. De todas formas, se ha observado que en la solubilización de proteínas de membrana, no sólo es importante la naturaleza de la proteína, sino también la presencia y naturaleza de otros componentes, en particular de los lípidos que rodean a la proteína [39, 40]. A pesar de los avances que se llevan a cabo en la solubilización de proteínas integrales de membrana, la mayoría no pueden ser solubilizadas con un solo detergente no-iónico o zwitteriónico y requieren la utilización de procedimientos específicos para membrana.
Agentes reductores:
La reducción y prevención de la re-oxidación de los puentes disulfuro es un paso crítico en la preparación de la muestra. Los agentes reductores son imprescindibles para romper los enlaces disulfuro tanto intra- como intermoleculares y conseguir una completa desnaturalización de las proteínas. Los agentes más comúnmente utilizados son el ditiotreitol (DTT) o el ditioeritritol (DTE), que son aplicados en exceso a concentraciones de hasta 100mM. Desafortunadamente, estos reactivos son ácidos débiles con valores de pK de 8.5 y 9, lo que significa que a pH básicos estarán ionizados, y por lo tanto migrarán hacia el ánodo durante el isoelectroenfoque. Estos agentes reductores, además, no son los más eficientes a la hora de
Herbert et al. propusieron el uso de tributilfosfina (TBP) como una alternativa al DTT [41]. El TBP es utilizado a concentraciones muy bajas (2mM), dada su reacción estequiométrica, pero este agente tiene desventajas como son su baja solubilidad en agua, su corta vida media, además de ser volátil, tóxico y tener un olor muy desagradable e irritante. Como alternativa se puede usar el TCEP (tris (2-carboxietil) fosfina. La elección del agente reductor no deja de ser dependiente de la muestra.
Durante el proceso de isoelectroenfoque, a puntos isoeléctricos superiores a 7, ocurre la oxidación inespecífica de los grupos tioles de las proteínas. Como resultado, se obtiene un patrón específico en el que se observan rayas horizontales o spots extras. Para evitar esta oxidación, GE Healthcare comercializa un producto llamado DeStreak Reagent. Este reactivo transforma los grupos tioles en disulfuros estables. De esta manera no solo evitamos el mal isoelectroenfoque en pI superiores a 7, sino que también se simplifica la imagen del proteoma ya que se reduce el número de spots causados por la oxidación de las proteínas. En este trabajo, se ha utilizado el DeStreak Reagent en la rehidratación de las tiras de isoelectroenfoque, mientras que en la muestra se ha utilizado 10mM de DTT como agente reductor, siguiendo las instrucciones del producto DeStreak Reagent.
Las modificaciones en las proteínas deben minimizarse ya que como resultado se obtendrán puntos artefactuales. En particular, hay que inactivar toda proteasa que pueda haber en la muestra para evitar digestiones parciales de las proteínas. Además, se debe evitar el calentamiento, por encima de 30°C, de la muestra que contenga urea, ya que la urea se degrada a cianato amónico; compuesto que carbamila aminoácidos que contengan aminas primarias, generando un cambio en su carga y por lo tanto modificando el punto isoeléctrico [36](Figura I.5).