La calorimetría de titulación isotérmica o ITC es una técnica sencilla y no destructiva que mide de manera directa el calor liberado o absorbido en procesos de interacción intermolecular, como es el caso de las asociaciones proteína-ligando. Los experimentos de ITC consisten en valoraciones calorimétricas de un volumen de uno de los reactivos (normalmente, la proteína) con cantidades controladas del otro reactivo (normalmente, el ligando), a presión y temperatura constantes. En consecuencia, el calor medido directamente durante la titulación corresponde a la entalpía de dicho proceso (Iglesias Bexiga, 2011). La calorimetría de titulación isotérmica permite obtener una caracterización termodinámica completa y precisa del proceso de unión, con la ventaja adicional de que, a diferencia de los métodos ópticos, las medidas calorimétricas no requieren la incorporación de marcas específicas. Así, mediante un único experimento se logra determinar la estequiometría, así como la constante de equilibrio y la energética del proceso (González Flecha, 2013). Respecto a este último aspecto, se destaca la capacidad de discriminar entre las contribuciones entrópicas y entálpicas que
Figura 7.4. Preferencia de unión a AGs evaluada por desplazamiento de DAUDA. Las medidas provienen de ensayos con dos o tres repeticiones.
acompañan al proceso de unión, enriqueciendo el análisis del mismo.
Para caracterizar la unión de As-p18 al ácido oleico, se midieron los parámetros termodinámicos mediante procedimientos de ITC estándar, empleando un equipo MicroCal VP-ITC (volumen de trabajo 1.4 mL, agitación 320 rpm, 25 °C). Todas las soluciones empleadas se desgasearon antes de su uso (Cooper & Johnson, 1994). El experimento se realizó por duplicado y cada titulación constó de 28 inyecciones sucesivas a intervalos de 4 min, de 10 μL de una solución de ácido oleico (0.325 mM, buffer fosfato 20 mM, pH= 7.6) sobre la celda del equipo conteniendo As-p18 en un buffer de idéntica composición (11.68 μM). A fin de favorecer la solubilidad del ligando, los buffers se prepararon con metil-β-ciclodextrina (MβCD, 2%). Como experimento de control se realizó la misma operación sobre una celda conteniendo solo buffer (para evaluar calores de dilución) y sobre As-p18 no deslipidizada (para examinar diferencias en la interacción). Los datos de titulación se corrigieron por los calores de dilución y se analizaron utilizando un modelo de unión de equilibrio con sitio único (MicroCal Origin) para dar la estequiometría aparente de unión (N), las constantes de asociación/disociación (KA = 1/KD) y la entalpía de unión (ΔH).
Como se ve en la Figura 7.5, el modelo de ecuaciones que describe el proceso (línea roja) se ajustó satisfactoriamente a la representación gráfica del calor intercambiado en cada inyección por mol de ligando, en función de la relación molar ligando/As-p18. La estequiometría determinada de 0.9 se correlaciona con la evidencia acumulada a nivel estructural y reportada por otros autores (Mei et al., 1997). La afinidad de unión, representada por una KD de 3.1 ± 0.2 μM, es comparable a la que exhibe AFABP por el mismo ligando (2.4 ± 0.1 μM) (LaLonde et al., 1994). Sin embargo, las comparaciones entre valores de KD, aún determinadas por el mismo método, pueden no ser del todo confiables ya que hay una fuerte dependencia vinculada a la concentración real de ligando y a cómo se haya preparado la solución de trabajo. Debido a la escasa solubilidad de los ligandos lipídicos, si no se toman las precauciones adecuadas, pueden cometerse errores por defecto en la determinación de la concentración disponible en solución de los ácidos grasos (Richieri et al., 2000). Esto podría explicar las diferencias en órdenes de magnitud encontradas en constantes de afinidad para distintas FABPs determinadas por ITC que no encuentran correlato relativo, con las KD determinadas por otros métodos como ADIFAB y Lipidex (Maatman et al., 1994; LaLonde et al., 1994; Balendiran et al., 2000; Lücke et al., 2003). Más allá de los valores de KD que indican que el proceso de unión es favorable desde el punto de vista de la energía libre
de Gibbs, es interesante analizar la llamada marca termodinámica (González Flecha, 2013). El análisis de la marca termodinámica básica permite la disección de la afinidad en sus contribuciones entálpicas y entrópicas. La interacción As-p18–ácido oleico mostró estar gobernada por una fuerte contribución entálpica (-15 kcal/mol) que compensó el efecto desfavorable en el término entrópico (-TΔS = 7 kcal/mol).
Tal como detalla LaLonde et al. (1994) para AFABP, los factores entálpicos y entrópicos medidos macroscópicamente son valores netos y están compuestos por múltiples componentes microscópicos, tanto positivos como negativos. Si bien no es posible relacionar de manera cuantitativa los datos termodinámicos y los eventuales eventos a nivel estructural, sí puede plantearse una interpretación cualitativa la cual se resume en la Tabla 7.2.
Figura 7.5. Calorimetría de Titulación Isotérmica de unión del ácido oleico a As-p18. Se muestra los valores de calor integrados para cada agregado en función de la relación molar ligando:proteína. La curva en rojo indica el ajuste del modelo de unión a los datos. En el recuadro se detallan los parámetros promedio de dos repeticiones.
-15 -10 -5 0 5 10 ΔH -TΔS ΔG kcal mol -1
El efecto favorable de disminución de entalpía suele asociarse a la formación de interacciones no-covalentes entre moléculas biológicas. De esta manera, la contribución entálpica al proceso de unión ácido oleico–As-p18 puede atribuirse a la estabilización del grupo carboxilato mediante interacciones del tipo electrostático con los grupos ionizables de las cadenas laterales 43Lys y 138Arg que forman parte de la cavidad proteica. Adicionalmente contribuiría, la formación de puente de hidrógeno con 140Tyr. Estas suposiciones basadas en el análisis de la estructura de As-p18 son consistentes con estudios de mutagénesis en AFABP donde se concluye que la interacción del carboxilato del ligando con cadenas laterales de residuos homólogos son componentes claves para el proceso de unión (Sha et al., 1993). En cuanto a la entropía del sistema, ésta comprende diversos factores. Por un lado tras la unión proteína ligando, habría un aumento de la entropía al liberarse moléculas de agua cuyo movimiento se hallaba restringido por las interacciones con la proteína y la solvatación del ligando. Sin embargo, la contribución global desfavorable del término TΔS podría deberse al mayor peso que reviste la reducción en el número de conformaciones del ligando libre y de As- p18 desde su forma apo. Si bien estas explicaciones son de carácter especulativo, podría vincularse la presunta disminución de entropía conformacional con los hallazgos presentados en el Capítulo 5, donde se prevé que la estructura de apo As-p18 presentaría
Figura 7.6. Marca termodinámica en la interacción entre el ácido oleico y As-p18. El proceso es impulsado entálpicamente compensando la disminución de entropía conformacional (ΔG= -7.6 kcal/mol; ΔH = -14.6 kcal/mol; -TΔS = 7 kcal/mol).
una flexibilidad incrementada en la región portal que es estabilizada por la unión al ligando.
Componentes Entálpicos Factores a favor
1. Interacciones Coulombicas entre el carboxilato del ligando y 43Lys y 138Arg.
2. Eliminación de interacciones Coulombicas desfavorables entre 43Lys y 138Arg en apoAs-p18. 3. Puente de Hidrógeno entre 140Tyr y el carboxilato del ligando.
4. Puente de Hidrógeno entre electrones π del ligando y átomos de cadenas laterales.
Factores a favor o en contra
5. Fuerzas de dispersión entre ligando y proteína, o entre ligando y red deagua preexistente. 6. Cambios en las interacciones electrostáticas de la proteína como resultado de cambios en la cavidad tras la unión del ligando.
7. Fuerzas de dispersión entre átomos del ligando en la forma libre y unida. Componentes Entrópicos
Factores a favor
8. Pérdida de agua desde la cavidad.
9. Disminución del orden del solvente cuando el ácido graso se retira del equilibrio en agua. Factores en contra
10. Pérdidad de grados de libertad por el ligando.
11. Pérdidad de grados de libertad por las cadenas laterales de la proteína como consecuencia de la unión al ligando.