Características de la modificación 6.1) El ADN introducido

El análisis de Southern blot realizado al ADN genómico del maíz MON810 reveló la incorporación de una única copia del gen truncado cry1Ab, junto con el promotor potenciado 35S del virus del mosaico de la coliflor (E35S) y las secuencias líder del gen hsp70. La señal de terminación nos en la región 3’, presente en el plásmido PV-ZMBK07, no se integró al genoma receptor, sino que se perdió debido al truncamiento de la región 3’ del casete génico. La proteína nativa Cry1Ab (HD-1) tiene un peso molecular de 131 kD, mientras que el gen cry1Ab insertado, expresado en la planta, codifica para una proteína truncada cuyo peso molecular es de 91 kD, tal como lo confirmaron los análisis por Western blot con extractos de tejido de la variedad MON810.

La evidencia demostró que ninguna secuencia del plásmido PV-ZMGT10 se integró al genoma del maíz MON810. Las pruebas posteriores de Southern blot indicaron que los genes que confieren tolerancia al glifosato (cp4 epsps) y resistencia a antibióticos (neo) no se transfirieron a la línea MON810. Además, la ausencia de las proteínas CP4 EPSPS y Gox se confirmó por Western blot. Se supuso que los genes para las proteínas CP4 EPSPS y GOX se habían insertado en la célula transformada inicial en loci genéticos separados del gen cry1Ab, y que luego se habían perdido a causa de la segregación durante los eventos de cruzamiento que dieron como resultado a la línea MON810.

6.2) Estabilidad genética de la característica introducida

Los datos sobre segregación y estabilidad señalan a un único sitio de inserción para el gen cry1Ab en el genoma de la variedad MON 810. La estabilidad de la inserción se demostró a través de numerosas generaciones de cruza. La línea MON810 derivó de la tercera generación de retrocruzamiento, y la integración estable del único inserto quedó demostrada durante las tres generaciones por Southern Blot.

6.3) Material expresado

El gen sintético cry1Ab se ligó con un fuerte promotor constitutivo y se modificó para lograr su máxima expresión en maíz. La secuencia de aminoácidos de la toxina expresada en el maíz modificado resultó ser idéntica a la de la toxina natural, y equivalente a la de la toxina muy empleada como pesticida biológico en la industria de alimentos orgánicos. La expresión promedio de dicha proteína, tal como se la midió en las muestras tomadas en seis puntos donde se realizaron ensayos a campo, fue de 9,35 µg/g de peso fresco (pf) en hojas y de 0,31 µg/g pf en semillas. La concentración de la toxina expresada, determinada en una única muestra tomada en

Maíz MON810

uno de los sitios, fue de 4,15 µg/g pf en la planta entera y de 0,09 µg/g pf en el polen. La expresión de la proteína osciló entre 7,93 y 10,34 µg/g pf en hojas, entre 0,19 y 0,39 µg/g pf en grano y entre 3,65 y 4,65 µg/g pf en la planta entera. La expresión de la proteína disminuyó a lo largo de la temporada de cultivo, acorde a lo indicado por las concentraciones de proteína Cry1Ab en las hojas analizadas a lo largo de dicha campaña. Se demostró que la proteína Cry1Ab se degrada rápidamente en el medio ambiente. Para la proteína expresada en la planta, los valores de TD50 y TD90 (tiempo hasta la degradación del 50% y del 90% de la actividad biológica original) fueron de 2 y 15 días, respectivamente.

7) Consideraciones sobre seguridad ambiental

7.1) Cruzamiento exogámico

Dado que la modificación genética objeto del evento MON810 no alteró la producción y la viabilidad del polen, la dispersión del mismo por el viento y la frecuencia de cruzamiento exogámico no deberían ser distintas a las de otras variedades de maíz. El intercambio génico entre el maíz MON810 y otras variedades de este cultivo debería ser similar al que se produce naturalmente entre las distintas variedades de maíz que se cultivan en la actualidad. En Canadá y Estados Unidos, donde no existen especies silvestres estrechamente relacionadas con el maíz, el riesgo de transferencia génica hacia otras especies parece ser muy bajo.

El maíz (Zea mays ssp. mays) hibrida libremente con el teosinte anual (Zea mays ssp. mexicana) cuando las especies están próximas. Esta especie silvestre emparentada con el maíz es originaria de América Central y no se encuentra en Canadá ni en Estados Unidos, salvo en plantaciones especiales. El Tripsacum, otro género relacionado con Zea, comprende 16 especies, 12 de las cuales son originarias de México y Guatemala. Tripsacum floridanum (hierba de la Florida) es nativa del extremo sur de Florida. El cruzamiento exogámico con las especies del género

Tripsacum no ocurre en estado silvestre y sólo con suma dificultad se puede cruzar al maíz con

dicho género.

7.2) Potencial de comportamiento como maleza

El evento MON810 no obtuvo ninguna ventaja competitiva, más allá de la que representa la resistencia al barrenador europeo del maíz (Ostrinia nubilalis). La resistencia al barrenador, en sí misma, no transformará al maíz en maleza o en agente invasivo de hábitats naturales, ya que no se ha modificado ninguna de sus características reproductivas o de crecimiento. El maíz cultivado no tiene probabilidades de establecerse en hábitats no cultivados, y no se han informado casos de maíz que haya sobrevivido como maleza. Zea mays no es una especie invasiva y es un débil competidor, con una dispersión de semilla muy limitada.

7.3) Efectos adversos secundarios y no intencionales

El historial de uso y la literatura sugieren que la proteína bacteriana Bt no es tóxica para los humanos, otros vertebrados e insectos benéficos. Se demostró que el núcleo activo de acción insecticida de la proteína Bt expresada en el maíz MON810 (Cry1Ab) es equivalente al de la proteína microbiana original. Esta proteína sólo es activa contra ciertos insectos lepidópteros y en Canadá o Estados Unidos ninguna de estas especies amenazadas o en riesgo de extinción pertenece a este grupo.

Se compararon las líneas endocriadas y los híbridos que expresan la proteína Cry1Ab con su equivalente no transformado para analizar la abundancia relativa de artrópodos benéficos. Los ensayos a campo indicaron que la proteína Cry1Ab no ejerce ningún efecto, directo o indirecto, en las poblaciones de artrópodos benéficos. Asimismo, se realizaron estudios de alimentación específicamente orientados a especies no blanco, incluyendo larvas y ejemplares adultos de abejas, crisopas (Chrysoperla rufilabris), himenópteros parasíticos, vaquitas de San Antonio, daphnias o pulgas de agua (invertebrados acuáticos), lombrices de tierra y colémbolos

Maíz MON810

(invertebrados edáficos). En ningún caso se observaron efectos adversos. En resumen, al compararlo con las variedades de maíz actualmente en el mercado, se determinó que el maíz MON810 no presenta mayores riesgos para los organismos con los que interactúa, incluyendo los seres humanos, con la excepción de especies de insectos lepidópteros específicas.

7.4) Impacto sobre la biodiversidad

El maíz MON810 no mostró características fenotípicas novedosas que pudieran extender su utilización más allá de la actual zona geográfica de producción de maíz. Dado que el riesgo de cruzamiento exogámico con especies emparentadas silvestres dentro de América del Norte es remoto, se determinó que el riesgo de transferencia de rasgos genéticos a partir del maíz MON810 hacia especies localizadas en entornos no controlados es despreciable.

7.5) Otras Consideraciones

Para prolongar la eficacia de las toxinas Bt expresadas en la planta, así como las formulaciones microbianas en spray de dichas toxinas, las autoridades regulatorias de Canadá y los Estados Unidos han solicitado a los obtentores que implementen Programas de Manejo de Resistencia de Insectos (Insect Resistant Management Programs). Estos programas son obligatorios para todos los ejemplares transgénicos que expresan la proteína Bt, incluyendo el maíz MON810, y establecen que los productores deben cultivar un determinado porcentaje de su tierra con variedades no transgénicas, para reducir la posibilidad de seleccionar poblaciones de insectos resistentes a la proteína Bt. Los detalles sobre el diseño y los requisitos específicos de cada programa son dados a conocer por las autoridades regulatorias pertinentes.

8) Consideraciones sobre seguridad alimentaria

8.1) Exposición a través de la dieta

Los seres humanos consumen en forma directa pocos granos enteros o maíz procesado, en comparación con la cantidad de ingredientes alimentarios a base de maíz. El maíz es una materia prima utilizada para obtener almidón, que en su mayoría es convertido en una variedad de productos edulcorantes y de fermentación, incluyendo jarabe de alta fructosa y etanol. El aceite de maíz se procesa a escala comercial a partir del germen. Estos productos se utilizan como ingredientes en numerosas preparaciones, incluyendo lácteos y productos de panadería, y se estima que el uso del grano obtenido de la variedad MON810 para alimentación humana no será diferente al de las variedades no transgénicas cultivadas a campo. Como tal, la exposición de los seres humanos, a través de la dieta, al grano obtenido de híbridos resistentes a los insectos no diferirá de la exposición al grano de otros maíces disponibles en el mercado.

8.2) Información nutricional

Se analizaron muestras de maíz MON810 cultivado en una serie de ensayos a campo realizados en distintas partes de Estados Unidos y Europa para obtener datos sobre perfiles de ácidos grasos, contenido de proteínas y humedad, composición de aminoácidos, fibra cruda, cenizas y fitatos. Las comparaciones de estos parámetros entre el maíz MON810 y una línea no transgénica control no revelaron diferencias significativas desde el punto de vista biológico.

Se estima que las variaciones observadas en la composición nutricional surgen de la variabilidad normal, y no como resultado de la introducción de la característica nueva. Expresados como porcentaje de peso seco, los resultados de los análisis de composición para la línea MON810 son, aproximadamente: proteína 13,1%; grasa 3,0%; humedad 12,4%; calorías 408 kcal/100 g; cenizas 1,6%; y carbohidratos 82,4%.

Maíz MON810

8.3) Toxicidad

El núcleo resistente a tripsina de la proteína Cry1Ab expresada en la variedad MON810 resistente a insectos resultó idéntico a la misma forma de la proteína presente en las formulaciones microbianas de Bt en spray que se vienen utilizado con total seguridad en la agricultura desde hace más de 30 años. El bajo potencial de toxicidad de la proteína Cry1Ab expresada en la planta quedó demostrado aún más por la falta de homología entre la secuencia de aminoácidos de esta proteína, con las de las toxinas proteicas conocidas, por la rápida digestión en contacto jugos gástricos sintéticos, y por la falta de toxicidad en los estudios de alimentación de animales de laboratorio.

Se llevó a cabo un estudio de toxicidad aguda oral para evaluar la posible toxicidad en mamíferos de la proteína Cry1Ab purificada a partir de Escherichia coli transformada con el mismo gen cry1Ab usado para obtener el maíz MON810. En este estudio se utilizó la proteína expresada en bacterias, ya que la cantidad de proteína que se pudo purificar a partir del tejido vegetal fue insuficiente. Se aportaron datos que demostraron la equivalencia molecular de la proteína Cry1Ab de origen bacteriano y de origen vegetal.

Se administró la proteína núcleo Cry1Ab a grupos de 10 ratones CD-1 machos y hembras, en dosis de hasta 4.000 mg/kg de peso corporal. Estas dosis son muy superiores al nivel de expresión que se encontró en las plantas de maíz resistentes a insectos, y representan un exceso de entre 200 y 1.000 veces respecto de la exposición esperable para el consumo de grano MON810. Como control, se administró a grupos equivalentes de ratones 4.000 mg/kg de albúmina sérica bovina o bien 66,66 mg/kg de solución de carbonato de sodio (vehículo control).

Se realizaron las observaciones clínicas y se determinó el peso corporal y el consumo de alimento. Un ratón hembra perteneciente al grupo control de administración falleció durante el ensayo el día 1. Este suceso se consideró resultado del procedimiento de intubación. Como no falleció ningún otro de los ratones tratados, ni ningún otro expuesto a dosis más elevadas, no se consideró que este evento estuviera relacionado con el tratamiento. Se mantuvieron los ratones en observación hasta 9 días después de la administración del tratamiento y no se observaron efectos relacionados con el tratamiento en el peso corporal, el consumo de alimento, la supervivencia, o las características patológicas analizadas durante la necropsia en aquellos ratones a los que se les administró la proteína de prueba Cry1Ab.

8.4) Alergenicidad

Se evaluó la posible alergenicidad de la proteína Cry1Ab analizando: i) las características físicoquímicas; ii) la homología de la secuencia aminoacídica con la de proteínas alergénicas conocidas; iii) la digestibilidad; y iv) el historial de uso seguro de insecticidas microbianos que contienen esta proteína. Aunque el peso molecular del núcleo resistente a tripsina de la proteína Cry1Ab, 63 kDa, estaba dentro del rango de valores de alergenos proteicos conocidos, a diferencia de la mayoría de ellos, Cry1Ab no estaba glicosilada. Una búsqueda de homología de secuencia aminoacídica entre la proteína Cry1Ab y 219 alergenos conocidos, usando una base de datos formada por las bases de datos de acceso público GenBank, EMBL, Pir y SwissProt, no reveló similitudes importantes.

Los productos del maíz son una alternativa importante a la harina de trigo para las personas celíacas, que padecen una intolerancia a los alimentos mediada por el sistema inmunológico cuya causa serían las gliadinas del trigo. En vista de la importancia de estos productos para estos individuos, se realizó una búsqueda de homologías entre la secuencia de aminoácidos de la proteína Cry1Ab y las de las gliadinas, sin detectarse homología entre ellas.

Se determinó experimentalmente la digestibilidad de la proteína Cry1Ab usando modelos in vitro de digestión de mamíferos. Se agregó la forma purificada de la proteína núcleo Cry1Ab resistente a la tripsina (63 kDa) a sustancias que simulan los jugos gástricos e intestinales y se incubó la mezcla a 37°C. La degradación de la proteína en los jugos digestivos se evaluó en el tiempo por medio de análisis de Western blot y ensayos biológicos con insectos. En los jugos gástricos

Maíz MON810

simulados, más del 90% de la proteína Cry1Ab se degradó después de 2 minutos de incubación, mientras que en los fluidos intestinales simulados, para la proteína núcleo Cry1Ab resistente a la tripsina la degradación cesó después de 19 horas de incubación. Este último resultado era el esperado, ya que las proteasas séricas, como la tripsina, son los componentes proteolíticos predominantes en los fluidos intestinales.

La fuente del gen cry1Ab tiene un largo historial de uso en cultivos alimentarios, como biopesticida, y no hay evidencia de efectos adversos. Este hecho, sumado a la falta de homología entre la secuencia aminoacídica de la proteína Cry1Ab y la de alergenos conocidos, junto con la rápida degradación de esta proteína en los jugos gástricos ácidos, son motivos suficientes que confirman, en conjunto, la falta de potencial alergénico de Cry1ab.

9) Reseña de las aprobaciones regulatorias

País Ambiental Alimentación humana y/o

animal

Alimentación

humana Alimentación animal Comercialización

Argentina 1998 1998 Australia 2000 Canadá 1997 1997 1997 Unión Europea 1998 1998 1998 Japón 1996 1997 1997 Corea 2002 Filipinas 2002 2002 Sudáfrica 1997 1997 1997 Suiza 2000 2000 Estados Unidos 1995 1996

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