laboratorio, su secuencia se contrastó con las secuencias existentes en las bases de datos. El resultado más llamativo de esta búsqueda fue la altísima homología que presentaba con la proteína CLE7 de Gallus gallus (81% de identidad), y que dio pie a llamar a la proteína recién identificada hCLE (human CLE). Además, se encontraron homólogos en otras especies más alejadas evolutivamente de
la humana, como Caenorhabditis elegans (31,2% de identidad) (Figura I5A), lo cual indicaba que se trataba de una proteína altamente conservada. Todos los anteriores resultados mostraban proteínas cuya función era hasta ese momento desconocida. Por último, se encontró que hCLE presentaba un 38% de homología de secuencia con la parte central de una proteína de Saccharomyces cerevisiae llamada Spt16 o Cdc68 (Figura I5B).
ensayos de inmunoprecipitación con un anticuerpo específico anti-hCLE en extractos nucleares de células HEK293T. Como se muestra en la Figura R6B, la proteína hCLE inmunoprecipita con el anticuerpo anti-hCLE y no con un anticuerpo control, y al imunoprecipitar hCLE, coinmunoprecipitan dos de las tres formas de fosforilación de la RNAPII, las reconocidas por los anticuerpos 8WG16 y H5. Estos resultado muestran que tanto la forma hipofosforilada como la hiperfosforilada en Ser2, se encuentran físicamente asociadas a hCLE. También se intentó co-inmunoprecipitar la forma hiperfosforilada en Ser5, pero a pesar de que esta isoforma se detecta en el extracto total, por razones que desconocemos no pudimos detectarla en los extractos nucleares, por lo que no fue posible evaluar su capacidad de asociación con hCLE.
1.3. hCLE está presente en sitios de transcripción activa
Puesto que hCLE se asocia físicamente a la RNAPII, quisimos comprobar si los sitios de colocalización eran puntos de transcripción activa, o si por el contrario eran reservorios de complejos inactivos. Para ello, realizamos ensayos de marcaje
in situ de la síntesis de RNA en células MDCK,
como se detalla en el apartado 3.1.1. de Materiales y Métodos. El ensayo consistió básicamente en permeabilizar células vivas que previamente habían sido sembradas sobre cubreobjetos y ponerlas en contacto con una solución que contiene los componentes necesarios para la reacción de transcripción y un nucleótido marcado con bromo (Br-UTP), durante una hora. Tras el pulso de síntesis de RNA, las células se fijaron y se procesaron para inmunofluorescencia. El RNA sintetizado durante el pulso se detectó con un anticuerpo anti- bromodeoxiuridina (anti-BrdU) y hCLE se detectó con el anticuerpo anti-hCLE. Comprobamos que la marca obtenida era realmente síntesis de RNA porque su aparición era dependiente de la presencia en la mezcla de los cuatro ribonucleótidos (ATP, CTP, GTP y Br-UTP, resultados no mostrados). Como se muestra en la Figura R7, la síntesis de RNA presentaba un patrón punteado y hCLE estaba presente en una fracción importante de los sitios de transcripción.
Para asegurarnos de que la colocalización ocurría entre hCLE y sitios de transcripción mediada por RNAPII, llevamos a cabo el mismo experimento en presencia de α-amanitina a una concentración de 100 μg/ml. A esta concentración de dicha droga se inhiben tanto la RNAPII como la RNAPIII, por lo que la única síntesis será la mediada por la RNAPI y, por lo tanto, de localización nucleolar. Como esperábamos, hCLE no colocaliza con los sitios de transcripción de la RNAPI (Figura R7). También se llevó a cabo este experimento a una concentración de α-amanitina de 5 μg/ml, para inhibir la actividad Spt16 es una proteína de 1053 aminoácidos
esencial para la levadura, con distribución nuclear y que es necesaria para la transactivación de numerosos genes, así como para la represión de otros, función que desempeña manteniendo la estructura de la cromatina.
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FUNCIÓN NUCLEAR DE hCLE
La proteína de levadura Spt16 se asocia a la proteína Pob3, para formar el complejo CP, o yFACT (yeast FACT) 39. Este complejo tiene análogos en otras especies, como DUF en Xenopus laevis 248, DRE en Drosophila melanogaster 305, FACT en humanos 251, y otros. Dada la función reguladora de la transcripción que tienen estos complejos 182, 250 y la similitud de secuencia de hCLE como único dato que nos pudiera acercar a su función, decidimos explorar la posibilidad de que la función de hCLE en el núcleo estuviera relacionada con la transcripción.
A) ASOCIACIÓN FÍSICA DE hCLE A LOS COMPLEJOS DE RNAPII
1.1. hCLE colocaliza con los complejos de la RNAPII
Para comprobar si hCLE se asociaba a la maquinaria de síntesis de mRNA, se llevaron a cabo estudios de doble inmunofluorescencia y posterior análisis por microscopía confocal en células MDCK. Los dobles marcajes se realizaron con un anticuerpo anti-hCLE en todos los casos junto con uno de tres anticuerpos que reconocen diferentes estados de fosforilación de la subunidad mayor de la RNAPII. Estos anticuerpos son: 8WG16, que reconoce la forma hipofosforilada y parcialmente fosforilada en Ser5; H14, que reconoce la forma hiperfosforilada en Ser5 y H5, que reconoce la forma hiperfosforilada en Ser2 del dominio CTD 254. Se utilizó el tipo celular MDCK, a pesar de no tratarse de células humanas, por ser células que presentan gran adherencia y esto las hace idóneas para la técnica utilizada más adelante en el apartado 2.1.3.
Como se puede apreciar en la Figura R6A, existe una buena colocalización entre la proteína hCLE nuclear y las tres formas de fosforilación de la RNAPII.
1.2. hCLE coinmunoprecipita con la subunidad mayor de la RNAPII
Continuando con la caracterización de la asociación entre hCLE y los complejos de transcripción de la RNAPII, llevamos a cabo