Caracterización genética de las cepas aisladas de U maydis

Una vez que se obtuvieron las esporidias de cada cepa, se procedió a determinar su filogenia, para lo cual se inició con la generación de suficiente biomasa, hasta obtener el árbol filogenético de todas las cepas como se detalla a continuación.

3.3.1 Producción de biomasa.

Para obtener el ADN, primero se tuvo que producir suficiente cantidad de biomasa de cada cepa, lo cual se logró bajo el siguiente procedimiento.

46

1. Se tomó aproximadamente un centímetro cuadro de colonias de cada cepa y colocó en un tubo con 5 mL de medio líquido de papa dextrosa (PDB, de laboratorios Bioxon) estéril. Y se incubó a temperatura ambiente a 175 rpm por 24 h.

2. Se tomaron 3 mL del cultivo y se adicionaron a 5 mL de PBD estéril fresco. Se incubó a 175 rpm y a temperatura ambiente por 48 h.

3. Se pasó el medio a tubos de centrífuga y se centrifugó a 2500 rpm por 10 minutos.

4. Se eliminó el sobrenadante y las células se enjuagaron dos veces por centrifugado con 1 mL de ADE. Se pasaron a un eppendorf de 2 mL eliminando el exceso de ADE.

5. Los eppendorf se introdujeron a nitrógeno líquido por 30 s. Se mantuvieron en congelación hasta la liofilización.

6. La biomasa contenida en los eppendorf se liofilizó por 24 h.

7. Se conservó a temperatura ambiente y en un lugar seco hasta la extracción de ADN, lo cual no debe sobrepasar 2 meses.

3.3.2 Extracción de ADN.

La extracción de ADN de cada aislamiento se realizó de acuerdo a Challen et al. (1995):

1. Se agregaron 650 µl de buffer de extracción (KCl 1M, EDTA 0.5M a pH 8.0, Triton al 20% y H20 destilada estéril) al eppendorf que contenía la biomasa de la cepa y se homogenizó.

2. Se le agregó 3 µl de RNAasa mezclando por inmersión.

3. Se incubó a baño María a una temperatura de 70 °C por 30 min. 4. Se centrifugó a 13,000 rpm a temperatura ambiente por 10 min.

5. Se tomó el sobrenadante y se filtró en una columna del Kit Quiagen (Plasmid Mini Kit, Cat N°12125), previamente equilibrada con 1 mL de buffer QBT.

6. Se lavó 4 veces con 1 mL de buffer QC.

7. Se eluyó con 700 µl de buffer QF y se colectó en un eppendorf de 1.5 mL.

8. Se adicionaron 700 µl de 2-propanol para precipitar el ADN, mezclando por inmersión. 9. Se esperó dos minutos y se centrifugó por 20 minutos a 13,000 rpm.

10. Se eliminó el 2- propanol, y se lavó el pellet con 500 µl de etanol al 70%. 11. Se centrifugó por 10 minutos a 13,000 rpm, y se eliminó el etanol. 12. Se secó el pellet en estufa por 30 min.

47 13. El pellet se resupendió en 20 µl de TE. 14. Se incubó en baño María por 30 minutos.

15. Se conservó en refrigeración hasta la determinación de la calidad del ADN.

3.3.3 Determinación de la calidad del ADN.

La calidad del ADN se determinó por el método de Sambrook et al., (1989).

1. En un gel de agarosa al 1% suplementado con bromuro de etidio (1µl / 100 mL), se colocó

en cada celda una mezcla de ADN constituida por 2 µl de ADN, 2 µl de colorante y 6 µl de buffer TE.

2. En otras dos celdas se colocaron los estándares, el estándar 1: 1l  DNA = 10 ng, y el estándar 2: 2l  DNA = 20 ng.

3. El gel se corrió por electroforesis a 70 V por 85 min.

4. Inmediatamente se determinó la calidad y cantidad del ADN en el transiluminador UV (Gel Doc 2000, Bio- Rad) que se controla por el micropocesador “Quantity one” (Figura 3.1)

5. Las muestras cuyo ADN resultó de calidad y cantidad adecuada, se mantuvieron en congelación hasta su uso para el PCR.

Figura 3.2 Gel de agarosa de algunas cepas de U.maydis aisladas para determinar la cantidad y calidad del ADN extraído

48 3.3.4 Reacción en cadena de la polimerasa (PCR).

El ADN con las características mencionadas, se amplificó diferencialmente, mediante

PCR, la región ITS1 (5´TCCGTAGGTGAACCTGCGG´3) e ITS4

(5´TCCTCCGCTTATTGATATGC´3) del rADN, mediante el siguiente procedimiento.

1. En un eppendorf de 200 µl, se adicionaron 5 µl de ITS1, 5 µl de ITS4, 25 µl de PCR Master y 15 µl de una solución de ADN con agua de PCR que contenían 40 ng/µl de ADN, para tener un volumen total de 50 µl.

2. Se colocó en el termociclador Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer) bajo las siguientes condiciones. Un ciclo inicial de desnaturalización a 95 °C por 1 min., seguida por 30 ciclos de 94 °C por 30 seg., 50 °C por 45 seg, 72 °C por 5 min. y un periodo final de extensión a 72 °C por 5 min.

3. Los productos de PCR se separaron por electroforesis en gel de agarosa del mismo modo que para el caso de ADN descrito anteriormente, excepto que en lugar de colocar los dos estándares mencionados, se colocaron 3l de DNA Molecular Weight Marker III, 0.12 - 21.20 (Figura 3.2)

4. La visualización de las bandas se realizó bajo luz ultravioleta del mismo modo que para el ADN mencionado arriba.

3.3.5 Purificación de los productos de PCR.

Los productos de PCR se purificaron utilizando el Kit Quiagen (QIA quik PCR Purification, Cat. N° 28106).

1. En una columna del Kit se adicionó 5 volúmenes de PB a un volumen del producto de PCR. 2. Se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto.

3. Se agregaron 750 l de PE.

4. Se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto.

5. Se eliminó el filtrado y se colocó un eppendorf de 1.5 mL para recuperar el siguiente filtrado. 6. Se adicionó 30 mL de EB o de agua de PCR. Se dejó reposar por 1 minuto y se centrifugó a 13,000 rpm por 1 minuto.

49

8. Los productos de PCR purificados se separaron por electroforesis en gel de agarosa del mismo modo que para el caso de ADN descrito anteriormente, pero además se colocaron 3l de DNA Molecular Weight Marker III, 0.12 - 21.20, y de igual forma el estándar 1: 1l  DNA = 10 ng, el estándar 2: 2l  DNA = 20 ng (Figura 3.3).

9. La visualización de las bandas se realizó bajo luz ultravioleta del mismo modo que para el ADN mencionado arriba.

Figura 3.3 Gel de agarosa de algunas cepas de U. maydis aisladas para determinar los productos de PCR

3.4 Secuenciación.

50

Los productos de PCR purificados se enviaron a secuenciar a SeqWright por

secuenciación directa de cada una de las cepas de U. maydis (Anexo A1. Secuencias de ITS-4 de Ustilago maydis del centro del centro de México).