3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
3.4 Caracterización molecular de nematodos fitoparasitos
Los resultados empleando los primers nem_18S_F y nem_18S_R amplificaron la región 18S rRNA en nematodos. Se obtuvieron resultados positivos para las muestras P225, P232, P236, P239 y P248 no obstante en la muestra P 253 resulto negativo, esto se deba posiblemente a un fallo en la extracción de ADN. Los productos de PCR obtenidos poseen un tamaño aproximado de 900pb, siendo superior a los 1000pb en Parámetros de evaluación Géneros fitoparasitos Pratyle n ch u s Helicoty lenchu s R otyle n ch u lu s Paratyle n ch u s Dityle n ch u s
Longitud del cuerpo 639.45 µm 812.12 µm 375.84 µm 320.41 µm 1213.36 µm Ancho del cuerpo 21.6 µm 29.67 µm 23 µm 23.14 µm 38.97 µm Tamaño de estilete 18.72 µm 26.89 µm 17.45 µm 27.1 µm 9 µm Vulva al extremo Anterior 85% 65% 68% 64 % 75 % Longitud de cola 17.69 µm 47.29 µm 15.67 14.78 µm 16 Ancho de cola 1.9 µm 1.69 µm - - -
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DE AGROPECUARIAS
algunos casos (anexos, figura 6.7).
En la tabla 3.2 las muestras P225, P232 y P236 muestra el tamaño de las bandas obtenidas para Pratylenchus el cual presento fragmentos de 813, 856, y 839 pb respectivamente, el código P239 presento un tamaño de 606 pb obtenidas para el genero Helicotylenchus, el código P248 con un tamaño de 805 pb , estos resultados fueron obtenidos al introducir la secuencia a la herramienta BLAST.
Tabla 3.2 Información obtenida por BLAST de la secuenciación molecular de las muestras de nematodos fitopatógenos.
Muestra (Código PCR) Muestra (Código extracción) Tamaño de secuencia (pb) Identificación Identidad (%) P225 E86 813
Pratylenchus brachyurus isolate CA106 clone 2 18S ribosomal
RNA gene, partial sequence
98
P232 E93 839
Pratylenchus brachyurus isolate CA83 clone 1 18S ribosomal
RNA gene, partial sequence
98
P236 E97 856
Pratylenchus brachyurus isolate CA83 clone 1 18S ribosomal
RNA gene, partial sequence
93
P239 E100 606
Paratylenchus sp. WK-2013 voucher J2-2 18S ribosomal RNA gene, partial sequence
97
P248 E112 805
Helicotylenchus dihystera partial 18S rRNA gene, isolated
in United Kingdom, St Albans
99
260 E124 653
Ditylenchus persicus isolate AA15_2 18S ribosomal RNA
gene, partial sequence
98 Ditylenchus destructor isolate
CH06 18S ribosomal RNA gene, partial sequence
98 Ditylenchus africanus isolate
DA 18S ribosomal RNA gene, partial sequence
98
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Así mismo el proceso de secuenciamiento permitió observar que existe un 98 % de similitud en la muestra P225 y p232 con la especie brachyurus del genero
Pratylenchus, la muestraP236 mostró un porcentaje de identidad considerado muy
bajo para la identificación, lo cual puede ser debido a que las secuencias presentaron errores de lectura. En la muestra P248 el género Helicotylenchus tiene un 99% con la especie dihystera; siendo estos géneros los encontrados en mayor población en el cultivo de Piña.
A partir de los productos de PCR obtenidos se procedió a un análisis de secuenciamiento de ADN, con estos datos se obtuvo secuencias de nucleótidos para las diferentes muestras las cuales fueron ensambladas para su análisis empleando programas informáticos con el fin de buscar similitudes con lo registrado en la base de datos y complementando con un análisis filogenético
El análisis filogenético se realizó empleando el algoritmo de Neighbor-Joining, mostrando las relaciones entre las muestras y sus posibles identificaciones en la base de datos. (Figura 3.10 y 3.11), alineando al género Pratylenchus con la especie
brachurus y al género Helicotylenchus con la especie dihystera.
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Figura 3.10 El análisis filogenético empleando el algoritmo de Neighbor- Joining para Pratylenchus
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El análisis filogenético puede permitir un mayor acercamiento a la especies de las muestras. Para los géneros Ditylenchus, Rotylenchulusy Paratylenchus(figrura 3.12 y 3.13) no es posible hacer un acercamiento mayor al obtenido por el análisis inicial, siendo necesario realizar el estudio de otro u otros genes a fin de definir la especie.
KY271078.1 Helicotylenchus microlobus isolate ND-Hg51 18S ribosomal RNA gene partial sequence internal transcribed spacer 1 complete sequence and 5.8S ribosomal RNA gene partial sequence GQ906356.1 Helicotylenchus crenacauda from China 18S ribosomal RNA gene partial sequence internal transcribed spacer 1 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2 complete sequence and e KM506856.1 Helicotylenchus broadbalkiensis isolate CD363 clone 2 internal transcribed spacer 1 partial sequence 5.8S ribosomal RNA gene complete sequence and internal transcribed spacer 2 partial seqe KM506855.1 Helicotylenchus digonicus isolate CD1072 clone 3 internal transcribed spacer 1 partial sequence 5.8S ribosomal RNA gene complete sequence and internal transcribed spacer 2 partial sequence KM506873.1 Helicotylenchus paxilli isolate CD694 clone 2 internal transcribed spacer 1 partial sequence 5.8S ribosomal RNA gene complete sequence and internal transcribed spacer 2 partial sequence KM506882.1 Helicotylenchus pseudorobustus isolate CD796 clone 1 internal transcribed spacer 1 partial sequence 5.8S ribosomal RNA gene complete sequence and internal transcribed spacer 2 partial seque P1100
MG437304.1 Helicotylenchus dihystera isolate GX-1 small subunit ribosomal RNA gene partial sequence internal transcribed spacer 1 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2 complete see MF401447.1 Helicotylenchus multicinctus isolate AD9 18S ribosomal RNA gene partial sequence internal transcribed spacer 1 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2 complete sequence ae
GQ906355.1 Helicotylenchus microcephalus from China 18S ribosomal RNA gene partial sequence internal transcribed spacer 1 5.8S ribosomal RNA gene and internal transcribed spacer 2 complete sequence ae
Figura 3.11 El análisis filogenético empleando el algoritmo de Neighbor-Joining para Helicotylenchus.
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.
Figura 3.13 El análisis filogenético empleando el algoritmo de Neighbor-Joining para Paratylenchus
Figura 3.12 El análisis filogenético empleando el algoritmo de Neighbor-Joining para Ditylenchus
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Los resultados morfológicos fueron corroborados molecularmente estableciendo la caracterización los dos principales nematodos fitoparasitos los cuales vienen causando daño a este cultivo.
Diferentes publicaciones han descrito los primers 5.8S y 18S como útiles para la identificación de nematodos en general, no obstante se determina que estos no pueden ser usados indistintamente para todos los géneros en estudio. Por esta razón estos primers podrán ser útiles en un futuro, siempre que se tenga en cuenta estas consideraciones.
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CAPITULO IV
4. CONCLUSIONES
Mediante las características morfológicas, morfometria y análisis moleculares se identificó a nivel de género los nematodos fitoparasitos Pratylenchus,
Helicotylenchus Paratylenchus Rotylenchulus y Dytilenchus, en muestras de suelo
y raíces de Ananas comosus L procedentes de Poroto La Libertad.
Los métodos de identificación utilizados permitieron identificar a nivel de especie con 100% de similaridad los nematodos fitoparasitos Pratylenchus brachyurus y
Helicotylenchus dihystera los cuales fueron predominantes en las muestras de
suelo y raíces analizadas.
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CAPITULO V
5. RECOMENDACIONES
Continuar las investigaciones para determinar las especies de nematodos fitoparásitos aún no identificados que se encuentran afectando las plantaciones de piña, aspecto esencial para e implementar estrategias de manejo.
Fomentar estudios que relacionen el comportamiento de los nematodos fitoparasitos en plantaciones comerciales de piña en la región con el comportamiento climático y las prácticas de manejo implementadas.
Realizar estudios dirigidos hacia el impacto económico que implica las poblaciones de nematodos fitoparásitos existentes en plantaciones de piña de la región, considerando el efecto en rendimiento de producción y costo de control.
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CAPITULO VI
6. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
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ANEXOS
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Figura 6.1 Campos del cultivo de Piña Var Roja trujillana en Poroto, La Libertad.
Figura 6.2 Proceso de la extracción del ADN y PCR en el laboratorio de Biología molecular
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Figura 6.3 Termociclador para el proceso de PCR
Figura 6.4 Cámara de electroforesis.
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Figura 6.5 Fotodocumentador
Figura 6.6 Análisis de productos de PCR para Gen 18S rRNA en nematodos Fitoparsitos