Caracterización molecular de SIRE

5.1.1 Parásitos y extracción de ADN

Los aislados de T. cruzi de las DTU I-VI analizadas se muestran en la Tabla 4 con su respectivo código, origen geográfico y clasificación. Los parásitos fueron cultivados en medio LIT líquido (NaCl 4 g/l, KCl 0,4 g/l, Na2HPO4 8 g/l, glucosa 2 g/l, triptosa 5 g/l, infusión de hígado 5 g/l, hemina 50 mg/l) suplementado con 10% de suero fetal bovino (SFB) y 100 µg/ml de gentamicina e incubados a 26° C.

Posteriormente, el ADN de los parásitos se obtuvo según lo indicado por Sambrook et al., 2001. A partir de un cultivo de parásitos en fase logarítmica de crecimiento, se recolectó el botón parasitario mediante centrifugación a 2.500

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r.p.m (revoluciones por minuto) durante 15 minutos (min), y se lavó con solución tampón PBS 1 X (NaCl 8 g/l, KCl 0,2 g/l, Na2HPO4 1,44 g/l, KH2PO4 0,24 g/l, pH 7,4). Tras la última centrifugación, los parásitos fueron resuspendidos en solución tampón de lisis a una concentración final de SDS al 1 %. Luego, el ADN fue extraído (V:V) con fenol; fenol-cloroformo-isoamilico 1:24:1; cloroformo-isoamilico 24:1 y precipitado con 2,5 volúmenes de etanol absoluto. La madeja de ADN obtenida se lavó con etanol al 70 % y se resuspendió en TE (Tris-HCl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 7,4) (Puerta y Urueña, 2005).

El ADN extraído se analizó mediante electroforesis horizontal en gel de agarosa al 1 %, utilizando TAE como solución tampón (Tris-HCl 0,04 M pH 7,2, ácido acético glacial 29,6 mM y EDTA 2 mM pH 8,0), con posterior tinción con bromuro de etidio (Sigma, St. Louis, USA), a una concentración final de 0,5 g/ml de agua destilada. Finalmente, la concentración de ADN se midió por espectrofotometría de U.V a 260 nm, teniendo en cuenta que una unidad de densidad óptica (DO) a 260 nm equivale a 50 µg/ml de ADN de doble cadena (Sambrook et al., 2001).

Finalmente, para corroborar la especie de cada cepa se utilizaron los iniciadores TcH2AF-R (Pavia et al., 2003) y para determinar el linaje T. cruzi I y II (antigua nomenclatura) se usaron los iniciadores TC/TCI/TCII (Yeo et al., 2005).

5.1.2 Secuenciación

Para obtener la secuencia completa de SIRE de los aislados estudiados, se diseñaron los iniciadores SIRE-1 (5’-TTAGGAGCTTGTGAAAAGAA-3’) y SIRE-2

(5’- AATAATCBTCCGGGCAG-3’) con base en la secuencia de referencia de SIRE con no. de acceso al GenBank Y08881 (Figura. 5).

La reacción de amplificación fue hecha en un volumen final de 25 μl conteniendo: 5 μl of ADN para una concentración final de 125 ng, tampón 1 X (10 mM Tris-HCl,

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pH 8.5, 500 mM KCl), 0,18 U/μl de Taq polimerasa de alta fidelidad (Roche®, Mannheim, Germany), 1,5 mM MgCl2, 200 μM de la mezcla de los deoxinucleosidos trifosfato (dNTP), y 20 pmol de cada iniciador. La reacción se corrió en un termociclador MJ Research PTC-100 ADN, utilizando el siguiente perfil: 95 °C/5 min, 35 ciclos de 95 °C/30 s, 50 °C/30 y 72 °C/30 s, y un ciclo final de 72 °C por 5 min. Los productos de amplificación obtenidos fueron analizados en un gel de agarosa al 1,5 % agarosa y teñidos con bromuro de etidio.

Los fragmentos obtenidos fueron purificados usando el estuche comercial Wizard® ADN Clean-Up System (Promega, Madison, USA), y posteriormente clonados en el plásmido vector pGEM®-T Easy (Promega, Madison, USA). Se seleccionaron dos clones por cada una de los aislados de estudio. Los fragmentos clonados fueron secuenciados utilizando el “ADN sequencing Kit” (Perkin Elmer, Massachusetts, USA) y la enzima Amplytaq FS ADN polimerasa (Applied Biosystems, Washington, USA). La reacción se llevó a cabo en un secuenciador automático 373 ADN Sequencer Strech de Applied Biosystems del Instituto de Parasitología y Biomedicina López Neyra (Granada, España). Las secuencias obtenidas fueron alineadas mediante los programas L-Align y MUSCLE (Multiple Sequence Comparison by Log-Expectation) (Pearson et al., 1988; Edgar et al., 2004). Para obtener la secuencia consenso de SIRE se utilizó el programa Java alignment editor “Jalviw” (Waterhouse et al., 2009). La búsqueda de homologías se realizó con el programa Blast-N (Altschul et al., 1994) usando diferentes bases de datos como las del GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), GeneDB (http://www.genedb.org) y TriTrypDB (http://tritrypdb.org). Para analizar la identidad de las secuencias del elemento SIRE entre las distintas DTU del parásito, se obtuvo una matriz de identidad utilizando el programa BioEdit v 7.0.5 (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html). Para determinar las temperaturas de fusión del fragmento amplificado de 234 pb en todos los aislados estudiados se utilizó la herramienta “Oligo Analyser” (http://www.idtADN.com).

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5.1.3 Ensayos de Southern blot

Para determinar la distribución genómica del elemento SIRE en las diferentes DTU de T. cruzi, 3 g de ADN genómico de cada uno de los aislados fueron digéridos con la endonucleasa de restricción AluI la cual se sabe corta en las posiciones 3, 8 y 419 de la secuencia de referencia de SIRE (número de acceso al GB Y08881). La digestión se realizó utilizando el amortiguador especificado por la casa comercial fabricante (Promega, Madison, WI, USA) y una relación de unidades de enzima/ g de ADN a digerir, de diez, en un volumen final de reacción de 60 l, durante 24 h a 37 ºC. Los ADN digeridos fueron corridos en un gel de agarosa al 0,8%.

La separación de los cromosomas de los diferentes aislados de T. cruzi

estudiadas se realizó mediante electroforesis de campo pulsado (PFGE), utilizando el equipo Pharmacia Biotech Gene Navigator apparatus (Pharmacia Biotech, New York, USA). Los bloques de los cromosomas que contenían 80x106 epimastigotes fueron cargados en un gel de agarosa NA (Amersham Bioscience, Inc., Uppsala, Sweden) (Puerta y Urueña, 2005) y separados utilizando 4 fases de pulsos homogéneos (N/S, E/W) con un corrido total de 80 horas a 84 voltios (V) y una temperatura constante de 12º C así: fase 1, 200 s (20 h); fase 2, 350s (20 h); fase 3, 500s (20 h) y fase 4, 700s (20 h).

Los geles de agarosa que contenían el ADN total digerido y los cromosomas

separados fueron transferidos a membranas de nylon “Zeta-Probe® Blotting

Membranes” (BIO-RAD, Philadelphia, USA) utilizando las instrucciones del fabricante. Para la hibridación se utilizó como sonda el fragmento de 239 bp amplificado con los iniciadores TcH2AF-R y marcado por ¨Random Primer¨ con el

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radioisotopo -32P-dCTP, utilizando el estuche comercial Prime IT II Random Primer Labeling Kit (Stratagen, La Jolla, USA).

Cumplida la hibridación, las membranas fueron lavadas brevemente en una solución de citrato de sodio (SSC) 2X y sodio dodecil sulfato (SDS) al 0,5 % (p/v) a temperatura ambiente, durante 5 min con agitación constante. Posteriormente, los filtros fueron lavados durante 15 min en cada una de las siguientes soluciones: SSC 1 X - SDS al 0,5 % (p/v), SSC 0,5 X - SDS al 0,5 % (p/v) y SSC 0,1 X - SDS al 0,5 % (p/v) a 42, 55 y 65 °C, respectivamente. A continuación, las membranas fueron expuestas a películas curix RP2 medical X-ray (Agfa, Morsel, Belgium) durante 1 a 4 h.

Con los perfiles obtenidos en los ensayos de Southern blot se construyó una matriz utilizando el coeficiente de similitud de Jaccard, seguido de su análisis

mediante el método “unweighted pair group method analysis” (UPGMA) con un bootstrap de 100 réplicas (García-Vallve et al., 1999). Los análisis se hicieron on- line en el sitio web creado para este propósito en http://genomes.urv.cat/UPGMA.

5.1.4 Determinación del número de copias del elemento SIRE

Para analizar la variabilidad en el número de copias de SIRE en aislados de diferentes DTU de T. cruzi, se realizaron ensayos de cuantificación relativa por PCR en tiempo real utilizando como normalizador el gen de única copia p2 de T. cruzi, que codifica para la proteína 60S acídica ribosomal (Duffy et al., 2009). La cuantificación de p2 se realizó de acuerdo a lo descrito por Duffy et al., (2009) y para la cuantificación de SIRE se utilizaron los iniciadores TcH2AF-R (Pavia et al., 2007).

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La reacción de PCR fue hecha en un volumen final de 15 μl conteniendo: 5 μl de ADN genomico de T. cruzi en diferentes concentraciones entre un rango de 105 a 10 parásitos, 3 l of LightCycler FastStart ADN MasterPLUS SYBR Green I (Roche®, Mannheim, Germany), and 0,3 M de cada iniciador. La reacción se corrió en el termociclador LightCycler 1.5 Instrument (Roche ®, Mannheim, Germany) utilizando el siguiente perfil: programa de denaturación 95 °C/10 min, programa de amplificación y cuantificación de 15 ciclos de 95 °C/10 s, 72 °C/10 s y 30 ciclos of 95 °C/10 s, 65 °C/10 s, 72 °C/10 s con una única medida de fluorescencia. El programa para la curva de disociación fue de 60-95 C con una tasa de calentamiento de 0,1 C/s por segundo y con una medida de fluorescencia continua y finalmente un paso de enfriamiento a 40 °C/30 s. La cuantificación se realizó por triplicado para cada cepa analizada. Para calcular el ratio de SIRE/ p2

se utilizó el modelo matemático “delta delta CP” con corrección de eficiencias (Pfaffl et al., 2001) y el valor de la eficiencia fue calculado mediante el software 4.0 del LightCycler 1.5 Instrument (Roche ®, Mannheim, Germany). Los resultados del número relativo de copias fueron expresados en unidades arbitrarias.