4. Resultados y discusión
4.1 Caracterización taxonómica de los aislamientos A20, 5.1 y 7.1
Con el objetivo de identificar molecularmente los tres aislamientos de interés, se llevó a cabo una extracción de ADN genómico de A20, 5.1 y 7.1 sobre la cual se realizó una PCR con el fin de amplificar el gen 16S rARN de cada cepa, obteniéndose un amplímero de aproximadamente 1500pb (Figura 4-1). Este fragmento, fue eluido del gel de agarosa y enviado a secuenciar en Macrogen (Corea del Sur). Las secuencias obtenidas fueron alineadas (Anexo D) y sometidas a comparación en la base de datos del RDP (Ribosomal Database Project), de este proceso se obtuvo que los tres aislamientos pertenecen al género Streptomyces.
Figura 4-1: Amplificación por PCR del gen 16S rRNA de los aislamientos A20, 5.1 y 7.1. Los carriles DSM y C- corresponden respectivamente a los controles positivo (cepa tipo de
Streptomyces racemocrhomogenes ATCC 23954) y negativo de la PCR, el patrón 1Kb plus de
Invitrogen fue utilizado como marcador de peso molecular (MPM).
Tradicionalmente, es aceptado que una cepa puede ser incluida dentro de una especie determinada si su porcentaje de similaridad para el gen 16S rARN es superior al 98.5% (Labeda, et al., 2011). En este caso en particular, la comparación con la base de datos de las secuencias del 16S rARN de A20, 5.1 y 7.1 arrojó varias especies posibles que superaban este límite de identidad, con las cuales se elaboró un árbol filogenético para cada uno de los aislamientos de interés (Figura 4-2).
El análisis filogenético del gen 16SrARN ubicó a las cepa A20 como cercanamente relacionadas con las especies S.racemochromogenes/S. polychromogenes (100 % de similaridad), mientras que la cepa 7.1 se ubicó en el clado de S. chrestomyceticus con valores de similaridad superiores al 99 % con las especies S. canarius y S. corchorusii respectivamente. La cepa 5.1 se ubicó en el grupo de S. roseoverticillatus, aunque su similaridad a nivel de secuencia fue de solo el 98 % y en el árbol forma una rama independiente que podría sugerir que se trata de una nueva especie (Anexo E).
Figura 4-2: Árbol filogenético generado para los Streptomyces A20, 5.1 y 7.1. Para la construcción del árbol filogenético, se utilizó Neighbour Joining como estrategia de agrupamiento. La cepa tipo Streptoalloteichus tenebrarius NBRC 16177 fue usada como grupo externo. Escala= 0.005
Con el objetivo de complementar la información obtenida de la caracterización molecular, se desarrollaron pruebas bioquímicas y se evaluaron características de crecimiento macroscópico en medios específicos según esta reportado en el manual Bergey (Tabla 4- 1 y 4-2). Gracias a los resultados obtenidos en este punto, se realizó la selección del medio ISP3 como agar diferencial para el crecimiento de los tres Streptomyces, teniendo en cuenta el crecimiento característico que presentaron las cepas en este medio, lo cual facilitó su estudio en posteriores ensayos.
Tabla 4-1. Pruebas bioquímicas realizadas a Streptomyces A20, 5.1 y 7.1. (+) Fermentación del azúcar o reacción positiva. (-) No hay fermentación del azúcar o reacción negativa. (Cat) Catalasa, (Oxi) Oxidasa.
Cat Oxi Glucosa Sucrosa Fructosa Ramnosa Arabinosa Inositol Xilosa Manitol
A20 + - + - - - -
7.1 + - + + + - - - - -
5.1 + - + - - - - + - -
Tabla 4-2: Características fenotípicas de crecimiento en medios diferenciales de los
Streptomyces A20, 5.1 y 7.1. Cada uno de los aislamientos fue sembrado por agotamiento en los medios solidos correspondientes; el crecimiento de las cepas fue monitoreado hasta el octavo día de incubación.
Nutritivo MH ACA ISP2 ISP3 ISP4
A20
Colonias definidas, opacas, color crema. No se desprenden con facilidad del medio
Colonias redondas granulosas, Color inicial: Blanca
Color final: Rosa pálido Pigmento: No produce Colonias redondas granulosas, Color inicial: Blanca Color Final: Rosado Pigmento: azul en la parte posterior que es reabsorbido cuando empieza a esporular Colonias redondas granulosas Color inicial: Blanca Color final: Rosa pálido. No produce pigmento 7.1 Colonias definidas, opacas, color crema. No se desprenden con facilidad del medio
Colonias redondas, granulosas,. Color inicial: Blanco
Color final: Blanco Producción de pigmento: ausente
Colonias redondas, granulosas,. Color inicial: Blanco
Color final: Gris Producción de pigmento amarillo (No se reabsorbe) Colonias redondas, granulosas. Color inicial: Blanco Color final: Blanco Producción de pigmento: ausente 5.1 Colonias definidas, opacas, color crema. No se desprenden con facilidad del medio
Colonias redondas algodonosas. Color inicial: Rosa pálido Color final: Rosa
pálido Pigmento: rosado
no se reabsorbe
Colonias redondas algodonosas. Color inicial: Rosa
pálido Color final: Rosado/rojo Pigmento: rojo no se reabsorbe Colonias redondas algodonosas. Color inicial: Rosa pálido Color final: Rojo
Pigmento: roja no se reabsorbe
La caracterización taxonómica del género Streptomyces ha constituido todo un reto para los investigadores debido al gran número de especies descritas, que ha generado lo que algunos autores denominan la sobre especiación del género Streptomyces (Anderson & Wellington, 2001). Numerosos investigadores han descrito que esta situación se debe principalmente al incremento en el interés industrial y académico de estas cepas, ocasionado particularmente por su amplio rango de producción de metabolitos secundarios. Este interés llevo a que en 1970 se hubieran descrito alrededor de 3000 especies dentro del género Streptomyces, teniendo en cuenta únicamente diferencias pequeñas en cuanto a características morfológicas y bioquímicas (metabolismo y pared celular entre otras), por lo cual no era de extrañar que existieran especies “sinónimo” dentro de las especies reportadas (Hopwood, 1999, Anderson & Wellington, 2001, Labeda, et al., 2011, Goodfellow, 2012).
Se han adelantado diferentes aproximaciones en cuanto al tema con el fin de aclarar la taxonomía de Streptomyces, siendo las más representativas el estudio adelantado por Williams y colaboradores (1983) y las investigaciones cooperativas realizadas dentro del “International Streptomyces Project (ISP)” (Labeda, et al., 2011). A pesar de estos esfuerzos, aun es difícil determinar si un aislamiento dado pertenece o no a una especie de Streptomyces previamente descrita en la literatura basándose únicamente en la secuencia del gen 16S rRNA o en características morfológicas y bioquímicas, tal como se vio en el presente estudio, en donde se obtuvieron resultados de similaridad de porcentajes iguales con diferentes especies, por lo cual no era posible discriminar con certeza a que especie correspondia cada aislamiento.
La técnica “Multi Locus Sequence Typing MLST” se ha propuesto como una herramienta valiosa que usa la heterogeneidad de varios genes “Housekeeping” además del 16S, para caracterizar y definir especies bacterianas. En la actualidad esta técnica está siendo implementada en el grupo de investigación y se espera que pueda aportar información concluyente sobre filiación taxonómica de los tres aislamientos objeto de estudio, lo cual es de particular importancia si se tiene en cuenta que la legislación actual exige la plena identificación de cualquier microorganismo que vaya a ser usado como principio activo de un bioinoculante.