Capítulo 4: Análisis preliminares y validación de instrumentos
1. Casos perdidos y supuestos básicos
DANA ŠAFÁŘOVÁ1, MIROSLAV GRIGA2, PAVEL HANÁČEK3, JIŘÍ HORÁČEK2, MILAN NAVRÁTIL1,
RADOVAN POKORNÝ4, VILÉM REINÖHL3, PETR SMÝKAL3,5, LENKA ŠVÁBOVÁ3
1 Katedra buněčné biologie a genetiky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci 2 Agritec – výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Šumperk
3 Ústav biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova Univerzita v Brně
4 Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova Univerzita v Brně 5 Katedra botaniky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci
Transgenosis and genetic engineering seems to be efficient alternative tool production of pea plants resistant to Pea enation
mosaic virus 1 (PEMV-1) in the situation when the convention breeding methods are ineffective. The strategy of pathogen
derived resistance mediated by coat protein gene was applied to obtain the tolerant transgenic pea lines. Between two strategies, coat protein mediated resistance conferred by full viral coat protein gene and PTGS resistance conferred by short coat protein gene fragment, the second one led to obtaining the first generation of resistant transgenic pea lines. The propagation PEMV resistance into next generation is evaluated.
Key words: Pea enation mosaic virus, PEMV-1, transformace, indukovaná rezistence.
ÚVOD
Virus výrůstkové mozaiky hrachu (Pea enation mosaic virus, PEMV-1) patří společně s virem mozaiky hrachu přenosné semenem (Pea seed-borne mosaic virus, PSbMV) k nejvýznamnějším virovým patogenům hrachu v České republice (Piáková et al., 2006). Tento virus způsobuje značné ztráty ve výnosu semen a kvalitě zelené hmoty. Vzhledem k tomu, že je velmi omezená nabídka kultivarů hrachu rezistentních vůči infekci PEMV, a také s ohledem na zdlouhavost klasických šlechtitelských postupů, představuje genetická transformace alternativní a účinný způsob ochrany rostlin vůči virové infekci. Tato technologie vede ke zlepšení zdravotního stavu rostlin, zvýšení výnosového potenciálu a také k podstatnému zkrácení šlechtitelského procesu.
Cílem práce je získání transgenních linií hrachu vykazujících odolnost vůči viru výrůstkové mozaiky hrachu (PEMV-1).
MATERIÁL A METODY Příprava vektoru a a transformace rostlin
Úplný gen (570bp) pro plášťový protein (cp) nebo jeho část (293 bp) byl klonován do pBluescript kazety nesoucí 35S-CaMV promotor a CaMV-polyA terminátor. Tato kazeta byla následně použita pro konstrukci plazmidu pWell, se selekčním (nptII) a reportérovým (uidA/gus-int) genem umístěným za cp inzertem. Plazmid byl následně vnesen do hyperviruletního kmene Agrobacterium tumefaciens EHA 105. Transformace byla provedena kokultivací klíčících semen různých kultivarů hrachu s odpovídajícím kmenem Agrobacterium tumefaciens a jejich následnou regenerací, se selekcí na základě exprese genů bar a gus podle Švábová et al. (2005) a Krejčí et al. (2007). Pozitivní rostliny byly následně dopěstovány a bylo získáno jejich semenné potomstvo.
Testování odolnosti transgenních linií vůči PEMV-1
Rostliny byly ve stádiu druhého až třetího pravého listů mechanicky inokulovány izolátem viru, PEMV58UP (Šafářová et al. 2008). První symptomy infekce byly pozorovány 10 dnů po inokulaci (dpi), a následně byl jejich rozvoj průběžně monitorován. Přítomnost viru byla ověřována 14 den po inokulaci DAS-ELISA testem (Loewe, Biochemica Ltd.) podle pokynů výrobce. V případě negativního výsledku byly rostliny opakovaně inokulovány stejným izolátem viru a rozvoj infekce byl testován pomocí DAS-ELISA opětovně 14 dnů po inokulaci (tj. 30dpi).
Kvantifikace virové infekce
Kvantifikace virové infekce byla provedena pomocí Verso™ SYBR® Green 1-Step QRT-PCR kitu (AB-gene) a vyhodnocena pomocí komparativní kvantifikační metody (RotorGene-6.0, Corbett Research). Z listů jednotlivých testovaných rostlin byla izolována celková RNA pomocí kitu
50
NucleoSpin RNA Plant (Macherey-Nagel GmbH & Co), pro amplifikaci viru pomocí QRT-PCR byla použita nově navržena kombinace primerů PEMV47.
VÝSLEDKY A DISKUSE
Embryogenní segmenty (kotyledony) pěti kultivarů hrachu, Merkur, Raman, Menhir, Komet a Zekon, byly úspěšně transformovány dvěma různými konstrukty - pWell05b nesoucím celý gen pro plášťový protein (cp) viru výrůstkové mozaiky hrachu (tzv. CPMR – ´coat protein mediated resistance´ strategie) anebo pWell08a nesoucím 293bp dlouhý cp fragment v ´sense´ a ´antisense´ orientaci (tvz. PTGS – ´post transcription gene silencing´ strategie). Úspěšně transformované rostliny, PCR/GUS pozitivní a vykazující expresi GUS byly dopěstovány a bylo získáno jejich semenné potomstvo T1. V generaci T1 bylo provedeno testování odolnosti jednotlivých rostlin vůči výrůstkové mozaice hrachu vyvolané infekcí virem PEMV-1.
Bylo testováno 95 rostlin transformovaných konstruktem pWell05b. Biologické testy na odolnost neprokázaly účinnost vloženého transgenu. Všechny sledované rostliny vykazovaly 14 dnů po mechanické inokulaci typické příznaky infekce – prosvětlování žilek, slabou chlorotickou mozaiku listů a tvorbu typických enací (výrůstků) na spodní straně listu; jejich intenzita a rozsah odpovídaly symptomům pozorovaných na kontrolních senzitivních rostlinách. Při dlouhodobém pěstování rostlin nebyly pozorovány žádné případy ozdravení rostlin, naopak docházelo k zesílení intenzity chlorotické mozaiky, která vedla v závislosti na kultivaru hrachu až ke vzniku nekrotických skvrn. Přítomnost transgenu byla ve sledovaných rostlinách prokázána pomocí PCR (Obrázek 2). Zvolená CPMR strategie navození odolnosti prostřednictvím exprese celého genu pro plášťový protein se ukázala být nefunkční, ačkoli byla již dříve úspěšně použita (Chowrira et al., 1998).
Jako druhá možná strategie bylo zvoleno navození odolnosti vůči viru prostřednictvím PTGS , tj. exprese krátkých fragmentů genu pro plášťový protein. Dosud bylo testováno 138 rostlin T1 generace různých kultivarů hrachu. Rostliny cv. Merkur/pWell08b, Raman/pWell08b, a Menhir/pWell08b vykazovaly typické příznaky infekce a u těchto kultivarů se nepodařilo selektovat žádnou odolnou linii. Obdobně v případě rostlin Zekon/pWell08b a Komet/pWell08b většina rostlin vykazovala obdobné symptomy infekce. V materiálu ale byly selektovány 3 linie (4 rostliny) Zekon/pWell08b a 8 linií (11 rostlin) Komet/pWell08b, které dlouhodobě nevykazovaly žádné symptomy infekce ani po opakované inokulaci virem (Obrázek 1). Testování přítomnosti viru pomocí DAS-ELISA potvrdila vizuální hodnocení, všechny rostliny vykazující symptomy infekce byly vyhodnoceny jako pozitivní, naopak u všech rostlin, které nevykazovaly příznaky infekce, nebyla přítomnost viru prokázána.
Výsledky imunochemického stanovení byly potvrzeny i pomocí QRT-PCR .
Jednotlivé rostliny, jakožto perspektivní materiál, byly proto dále dopěstovány a bylo získáno jejich potomstvo. V současné době probíhá biologické a molekulární testování takto odvozených transgenních linií.
Obrázek 1: Transgenní rostliny hrachu po inokulaci virem enační mozaiky hrachu, (A) listy odolné rostliny, (B) listy vnímavé rostliny.
51
Obrázek 2: Detekce transgenu v testovaných rostlinách
(dráha 1: negativní netransgenní kontrola, dráhy 2-5: transgenní rostliny; šipka označuje produkt správné velikosti)
ZÁVĚR
Transgenoze se jeví být vhodným nástrojem pro navození odolnosti hospodářsky významných rostlin vůči virové infekci v případech, kdy neexistují vhodné přirozené zdroje rezistence. Tato technika byla proto použita pro navození odolnosti hrachu vůči významnému patogenu, viru výrůstkové mozaiky hrachu (PEMV-1). Použití CPMR strategie, tj. transformace rostlin celém genem pro plášťový protein se ukázala být jako neúčinná. Naopak PTGS strategie založená na transformaci rostlin jen parciálním fragmentem cp genu vedla k získání v T1 generaci perspektivních linií vykazujících odolnost vůči PEMV. Následující T2 generace je testována s cílem získat stabilní linie vykazující odolnost vůči PEMV.
Poděkování: Tato práce byla realizována za podpory projektu NAZV QI91A229.
LITERATURA
CHOWRIRA, G.M. – CAVILEER, T.D. – GUPTA, S.K. – LURQUIN, P.F. – BERGER, P.H. 1998. Coat protein-mediated resistance to pea enation mosaic virus in transgenic Pisum sativum L. In Transgenic Research vol. 7, 1998, pp. 265–271.
KREJČÍ, P. – MATUŠKOVÁ, P. – HANÁČEK, P. – REINÖHL, V. – PROCHÁZKA, S. 2007. The
transformation of pea (Pisum sativum L.): applicable methods of Agrobacterium tumefaciens-mediated gene transfer. In Acta Physiol. Plant. vol. 29, 2007, pp. 157–163.
PIÁKOVÁ Z. – POKORNÝ, R. – DOSTÁLOVÁ, R. 2006. Výskyt virových patogenů hrachu na území ČR. In Úroda vol. 2, 2006, pp. 10-11.
SAFAROVA, D. – NAVRATIL, M. – PETRUSOVA, J. – POKORNY, R. – PIAKOVA, Z. 2008. Genetic and biological diversity of the Pea seed-borne mosaic virus isolates occurring in Czech Republic. In ActaVirol. vol. 52, 2008, pp. 53–57.
ŠVÁBOVÁ, L. – SMÝKAL, P. – GRIGA, M. – ONDŘEJ, V. 2005. Agrobacterium-mediated transformation of Pisum sativum in vitro and in vivo. In Biol. Plant. vol. 49, 2008, pp.361–370.
Adresa autorov:
prof. RNDr. Milan Navrátil, CSc., Mgr. Dana Šafářová, Ph.D.; Katedra buněčné biologie a genetiky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc – Holice; e-mail: [email protected], [email protected].
RNDr. Miroslav Griga, CSc, Mgr. Jiří Horáček, Ph.D., Ing. Lenka Švábová, Ph.D.; AGRITEC, výzkum, šlechtění a služby s.r.o., Zemědělská 16, 787 01 Šumperk; e-mail: [email protected], [email protected], [email protected].
Ing. Pavel Hanáček, Ph.D., Mgr. Vilém Reinöhl, CSc.; Ústav biologie rostlin, Agronomická fakulta, Mendelova Univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno; e-mail: [email protected], [email protected]..
doc. Ing. Radovan Pokorný, Ph.D., Ústav pěstování, šlechtění rostlin a rostlinolékařství, Agronomická fakulta, Mendelova Univerzita v Brně, Zemědělská 1, 613 00 Brno.
Ing. Petr Smýkal, Ph.D., Katedra botaniky, Přírodovědecká fakulta, Univerzita Palackého v Olomouci, Šlechtitelů 11, 783 71 Olomouc – Holice; e-mail: [email protected].
52