CECILIA GARCIA MARTINEZ

Pági

na

1

Objetivos

 Separar las proteínas plasmáticas, mediante la técnica de electroforesis vertical en poliacrilamida (PAGE-SDS) en un equipo Mini-PROTEAN® Tetra Cell Systems de BIO-RAD.

 Manejar adecuadamente el equipo y reactivos necesarios para realizar la electroforesis PAGE-SDS.

 Identificar el tipo de proteína al que corresponden cada una de las bandas observadas en el gel de electroforesis.

Antecedentes académicos

 Estructura de las proteínas.

 Métodos de purificación de proteínas.

 Carga eléctrica de las proteínas.

 Fundamento de la técnica de electroforesis.

 Proteínas presentes en el plasma sanguíneo.

Introducción

Las proteínas se encuentran presentes en todas las estructuras de la célula y son las moléculas más activas en la vida celular. Las proteínas son sustancias complejas formadas necesariamente por los elementos: C, H, O, N, S y en algunos casos fósforo. Son de alto peso molecular (entre 5000 a varios millones de Daltons), forman dispersiones coloidales y están compuestas por L-alfa- aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos (20 aminoácidos), arreglados en secuencia lineal y se pliegan en una notable diversidad de formas tridimensionales, que les proporcionan una correspondiente variedad de funciones.

Debido a que su conformación se mantiene por fuerzas débiles, es fácilmente alterada por un ligero cambio de pH, temperatura o disolventes. Son muy reactivas ya que tienen muchas cadenas laterales con restos de aminoácidos con grupos aniónicos o catiónicos. Asimismo, la hidrólisis parcial de una proteína se realiza por medio de ácidos, bases o enzimas para la obtención de moléculas más pequeñas, por otro lado con una hidrólisis total se obtienen los aminoácidos que la componen.

Pági

na

2

La electroforesis constituye una parte importante del procedimiento rutinario del análisis de proteínas, ya que es un método analítico–semipreparativo cuyo principio básico consiste en la migración de las moléculas a través de un gel u otro tipo de matriz de naturaleza porosa, en el cual, por acción de un campo eléctrico, serán separadas de acuerdo a su tamaño o peso molecular. Para controlar el avance de la separación de las moléculas en la matriz y establecer un patrón de fragmentos, las moléculas deberán ser teñidas con diferentes colorantes. Estos pasos facilitan la visualización de las moléculas a manera de simples

bandas las cuales serán

posteriormente analizadas e

interpretadas.

La electroforesis de proteínas en geles con una matriz de poliacrilamida, comúnmente denominada electroforesis en poliacrilamida (PAGE, 'polyacrilamide gel electrophoresis') es sin duda alguna una de las técnicas más ampliamente usadas para caracterizar mezclas complejas de proteínas (aunque existen otras variantes como la electroforesis capilar, isoelectroenfoque, electroforesis en dos dimensiones, etc.). La electroforesis en poliacrilamida es un método conveniente, rápido y económico a nivel de muestra ya que se requieren sólo cantidades del orden de microgramos de proteína.

Las proteínas presentan una carga eléctrica neta que depende del contenido de una serie de aminoácidos (fundamentalmente ácido glutámico, ácido aspártico, lisina, arginina e histidina) y del grado de ionización de éstos al pH del medio en el que se encuentren. Si se encuentran en un medio que tenga un pH diferente al de su punto isoeléctrico tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo eléctrico.

En los soportes no restrictivos, la separación depende de la densidad de carga de las moléculas y, así, cuanto mayor sea la densidad, mayor será la velocidad de migración en un campo eléctrico hacia el polo que determine su carga neta. Asimismo la velocidad de migración es proporcional a la relación entre las cargas de la proteína y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de masa más rápida será la migración. Una ventaja importante de los geles de poliacrilamida es que son químicamente inertes, transparentes y estables en un rango amplio de pH, temperatura y fuerza iónica.

Fig. 1- Esquema de una electroforesis vertical.

CECILIA GARCIA MARTINEZ

Pági

na

3

Luego de la electroforesis, las bandas separadas pueden visualizarse en el gel si se sumergen en una solución de un colorante (azul brillante de Comassie), que se une fuertemente a proteínas. Si las proteínas en la muestra son radioactivas, el gel puede secarse y luego apoyarse sobre una película sensible a los rayos X (autorradiografía). Si se cuenta con un anticuerpo contra la proteína de interés, se puede utilizar un proceso llamado inmunotransferencia o Western Blot.

Actualmente la electroforesis es utilizada mayormente en el ámbito clínico para identificar la presencia de proteínas anómalas, la ausencia de alguna de las proteínas normales o detectar anomalías en grupos de proteínas, ya sea que estén aumentados o disminuidos. De esta manera se permite orientar el diagnóstico hacia una enfermedad u otra. La presencia de una anomalía en un patrón electroforético raramente es diagnóstica por sí misma, aunque sí proporciona una pista.

Proteínas plasmáticas.

La sangre es un tejido que circula dentro de un sistema virtualmente cerrado, el de los vasos sanguíneos y se encuentra compuesta por elementos sólidos (eritrocitos, leucocitos y plaquetas) suspendidos en un medio líquido, el plasma. El plasma está formado por agua, electrolitos, metabolitos, nutrientes, proteínas y hormonas.

En la actualidad se han aislado y caracterizado alrededor de 100 proteínas del plasma, sin embargo las funciones de una gran parte de ella permanecen aún desconocidas, la mayoría son glicoproteínas, presentando en algunos casos variaciones genéticas.

Las proteínas plasmáticas pueden clasificarse en los siguientes grupos o sistemas:

 Inmunoglobulinas.

 Sistema del complemento.

 Sistema de coagulación y fibrinólisis.

 Inhibidores de las proteinasas.

 Sistema de lipoproteínas.

 Proteínas de transporte.

 Proteínas de función desconocida.

 Enzimas y otras proteínas.

El plasma sanguíneo humano contiene normalmente 6.5 a 8.0 g/dL de diferentes proteínas con funciones específicas, que pueden ser separadas mediante diversas técnicas. Aún después de la precipitación de las proteínas, el plasma contiene todavía, cierta cantidad de ellas, llamadas proteínas residuales, provenientes del metabolismo de las sustancias nitrogenadas de los alimentos. Están formadas en un 50% por carbámidos, que son grupos amínicos libres unidos a anhídrido

CECILIA GARCIA MARTINEZ

Pági

na

4

carbónico, por aminoácidos (25%), creatinina, ácido úrico y otros componentes nitrogenados aún no bien identificados.

Las principales proteínas plasmáticas son: fibrinógeno, albúmina y globulinas, de estas últimas se conocen tres: alfa, beta y gamma.

El uso de la electroforesis permite, después de un proceso de tinción, la resolución de 5 bandas de proteínas plasmáticas. Designadas albúminas, y globulinas α1, α2, β y ɣ_.

Albúmina

La proteína más abundante del plasma es la albúmina, con una concentración de aproximadamente 4.5 g/dL. Por su alta concentración esta proteína contribuye a la conservación de la presión coloidosmótica de la sangre y representa una de las reservas corporales más importantes de aminoácidos. La albúmina tiene sitios de unión para sustancias no polares y por eso puede funcionar como una proteína transportadora de ácidos grasos de cadena larga, de bilirrubina, fármacos y algunas hormonas esteroides y vitaminas. La seroalbúmina fija además los iones Ca2+ _{y Mg}2+_{. Entre las proteínas plasmáticas importantes esta es la única no}

glucosilada. La transferrina o prealbúmina transporta la hormona tiroidea tiroxina y sus metabolitos.

Globulinas

Las globulinas α y β participan en el transporte de lípidos, hormonas, vitaminas y de los iones metálicos. Además constituyen los factores de coagulación, inhibidores de las proteasas y las proteínas del sistema de complemento. Las ᵞ- globulinas participan en los sistemas de defensa del organismo funcionando como anticuerpos: inmunoglobulinas G, M, A, D y E.

Fig. 2- Bandas de proteínas

plasmáticas observadas en una electroforesis.

(http://perso.wanadoo.es/sergioram1/Pro teinas.htm)

CECILIA GARCIA MARTINEZ

Pági

na

5

Esquema 1. Cámara de electroforesis de proteínas Mini-PROTEAN® Tetra