Ciclo de multiplicación 1

En el ciclo de multiplicación 1, el análisis estadístico (p-valor=0.3803) indicó no existen diferencias estadísticas entre las variedades (Anexo 7).

En la Figura 13 se observa el comportamiento de cada variedad respecto a la tasa total de velocidad de la multiplicación, donde se aprecia una mayor tasa de multiplicación en la variedad White Sim, cercana a 0.66 explantes/día. La variedad que presentó la menor tasa de multiplicación fue Orange Bri (0.22 explantes/ día). Sin embargo las diferencias no son estadísticamente significativas entre las variedades.

0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7

Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim

V al o res to ta les T V M ( exp lan tes / d ía )

Figura 13. Tasa de multiplicación en el ciclo de propagación 1, para las variedades Mercedes, Orange Bri, Picote Vanesa y White Sim de Clavel.

Durante este ciclo, la menor tasa de pérdida correspondió a la variedad Marfil (0), significativamente diferente a los valores presentados por las demás variedades. Mientras que la variedad Orange Bri presentó la mayor tasa de pérdida con un porcentaje del 35% (Figura 14).

0% 5% 10% 15% 20% 25% 30% 35% 40%

Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim V al o re s to tal es T P C AB A AB BC

Figura 14. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de multiplicación 1 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

La tasa de pérdida estuvo asociada con la oxidación de los explantes. Este fenómeno se presentó como consecuencia de la hiperhidratación severa de los brotes.

Saher et al., (2004) plantean que en los tejidos hiperhidratados se observa un aumento de las concentraciones de hierro. Estos cambios en los contenidos de hierro pueden generar estrés oxidativo al convertir radicales superóxido y H2O2 no reactivos, en radicales hidroxilo muy tóxicos. De igual forma el hierro

catalítico (niveles elevados de hierro) promueve la descomposición de lípidos hidroperóxidos a radicales alkoxy (LO) y peroxilo (LOO), lo que contribuye al aumento de la peroxidación de lípidos. Dicho estrés puede conducir a la muerte tisular.

Adicionalmente el exceso de agua en los tejidos puede causar niveles de saturación, causando hipoxia. Bajo estas condiciones de estrés anaeróbico se pueden producir niveles tóxicos de H2O2 generando así estrés oxidativo.

Es probable que por estas razones, los tejidos que presentan hiperhidratación severa se oxiden lo cual puede conducir a la muerte celular.

Desde otra perspectiva la tasa de pérdida pudo estar condicionada por las características de las plantas donadoras, ya que éstas se encontraban bajo condiciones que afectaban su fisiología; dicho factor se refiere al cambio de temperatura durante la termoterapia. Read & Economou (1987) afirman que el desempeño del explante en condiciones in vitro puede estar influenciado por las características fisiológicas de la planta donadora.

6.2.2.2 Ciclo de multiplicación 2

En el segundo ciclo de multiplicación, la variedad White Sim sigue presentando la mayor tasa de velocidad de multiplicación (1.49 explantes /

día). La respuesta más baja la obtuvo Mercedes con un valor de 0.68 explantes/ día (Figura 15).

0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 1,6 1,8

Mercedes Picote Vanesa White Sim

Va lo re s t o ta le s T V M ( ex p la n te s / d ía )

Figura 15. Tasa de velocidad de multiplicación en el ciclo de propagación 2 para las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.

Estas diferencias pueden estar relacionadas con características del material donante (planta madre) como son: edad, posición del esqueje y el número de podas (“flush”, se refiere al número de cosechas de esquejes). Trabajos

realizados en Corylus avellana L reportan que la multiplicación de esta

especie utilizando explantes provenientes de plantas intactas (no

revigorizadas in vivo) o de plantas con podas leves o distanciadas entre sí,

fue mas difícil que aquellas que habían recibido tratamientos revigorizantes más intensos. Se concluyó por lo tanto que la utilización de material vegetal ontogénica y fisiológicamente juvenil, permite mejores tasas de multiplicación

durante el cultivo in vitro (Sánchez-Olate et al., 2002; 2004).

Durante este ciclo para las 3 variedades aumentaron los valores de la tasa de multiplicación con relación al resultado anterior (ciclo de multiplicación 1).

Este resultado puede estar asociado con la revigorización (“rejuvenecimiento”) de los tejidos que se expresa con el aumento de la

capacidad morfogenética. Al respecto Sánchez- Olate et al., (2004) afirman

que la revigorización (“rejuvenecimiento”) en el cultivo in vitro se traduce en

un aumento de la tasa de multiplicación a través del tiempo.

Reafirmando lo anterior Díaz – Sala et al., (1995) reportan que brotes de

Corylus avellana L. introducidos in vitro, incrementaban su revigorización

(“rejuvenecimiento”) parcial a medida que aumentaba el número de subcultivos en presencia de BAP (Bencil amino purina).

La reversión hacia un estado juvenil puede traducirse en una morfología diferente, modificaciones de las características fisiológicas, y una mayor aptitud para el enraizamiento. Estudios realizados en Sequioa sempervirens reportan mayores tasas fotosintéticas, incrementos en los contenidos de nitrógeno y en las tasas respiratorias en tejidos revigorizados. Esto se expresa en crecimientos más rápidos y vigorosos de las plantas, relacionado con el aumento de la síntesis de proteínas favorecido por los altos contenidos

de nitrógeno y por la energía liberada por la respiración (Huang et al., 2003).

La revigorización (“rejuvenecimiento”) de las plantas in vitro parece estar

favorecida por la ruptura de las interacciones entre el ápice y los diferentes órganos de la planta madre, ya que se ha visto que en una misma planta se encuentran, yemas en diferentes estados de crecimiento (por ejemplo crecimiento activo, reposo vegetativo y letargo inducido). De igual, forma se ha descrito que la revigorización (“rejuvenecimiento”) es favorecida por el pequeño tamaño del explante, el reducido número de células que lo componen y las constantes podas (Margara, 1988).

Adicionalmente el aumento en la tasa de multiplicación pudo estar asociado

con el tipo de explante utilizado, es decir, el meristemo. Hartmann et al., 1997

reportan que al usar tejido meristemático proveniente de zonas de intensa

división celular como son las yemas apicales o axilares, se produce una organogénesis directa, manifestada en la formación de un nuevo brote y raíces a partir de la yema explantada. Estas yemas con una adecuada composición del medio de cultivo pueden ser inducidas a la brotación múltiple, aumentando así la tasa de multiplicación de la especie.

Corroborando lo anterior Smith (1992) expone que los tejidos meristemáticos jóvenes demuestran tener mayor capacidad regenerativa. Por otro lado el tamaño del explante también influye, ya que los explantes grandes poseen un potencial regenerador considerablemente mayor con respecto a los de menor tamaño, los cuales por su parte presentan una viabilidad y capacidad regenerativa más baja.

En el ciclo de multiplicación 2 se presentaron diferencias estadísticas para la tasa de pérdida entre las variedades. Las variedades Marfil y Orange Bri obtuvieron valores de 86.4 y 88 % respectivamente siendo significativamente diferentes a las variedades Mercedes (27.3 %), White Sim (13.7 %) y Picote Vanesa (13.5 %) a su vez esta variedad presentó la tasa mas baja pero esta no difiere estadísticamente de White Sim. En la figura 16, se describe el comportamiento de cada una de las variedades con relación a la tasa de pérdida.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100%

Marfil Mercedes Orange Bri Picote Vanesa White Sim V al o re s to tal es T P A A B CB C

Figura 16. Valores totales de la Tasa de Pérdida (TP) en el ciclo de propagación 2 de las 5 variedades de Dianthus caryophyllus.

6.2.2.3 Efecto de la concentración de agar en la hiperhidratación

Los datos presentados en la Figura 17 indican el porcentaje de brotes hiperhidratados y no hiperhidratados de cada variedad respecto al tratamiento utilizado. El porcentaje de brotes hiperhidratados disminuyó con el aumento de la concentración de agar. Las variedades Mercedes y White Sim presentaron un comportamiento similar entre sí, en las 2 variedades los porcentajes más altos de brotes hiperhidratados se obtuvieron en el control (7 % de agar) (89.2 y 83.3 % respectivamente) mientras que los porcentajes más altos de brotes no hiperhidratados ocurrieron en el tratamiento 1(8 % de agar). Sin embargo, el porcentaje de brotes hiperhidratados y no hiperhidratados de la variedad Picote Vanesa fue similar en el control y en el tratamiento 1.

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

T1 Control T1 Control T1 Control

Mercedes Picote Vanesa White Sim

B rot e s ( % ) Hiperhidratados No Hiperhidratados

Figura 17. Efecto de la concentración de agar sobre la hiperhidratación de los explantes de las variedades Mercedes, Picote Vanesa y White Sim durante la etapa de multiplicación. T1: 8 % de agar; Control: 7 % de agar.

Estos resultados indican que el aumento en la concentración de agar disminuye el porcentaje de brotes hiperhidratados en las variedades estudiadas. Al respecto Leshem (1983), afirma que la concentración de agar en el medio influye en la morfogénesis de los brotes por la reducción del potencial hídrico del medio, causándoles hiperhidratación. Este autor concluye que el aumento en la concentración de agar en el medio produce un leve estrés hídrico dando como resultado un mayor número de plantas no hiperhidratadas.

Complementando este planteamiento, Kevers & Gaspar (1986), explican que las condiciones de hiperhidratación en medios líquidos o en medios sólidos con altos contenidos de agua inducen a un exceso en la toma de agua de las plantas de clavel. Esta abundancia en la cantidad de agua se localiza en el espacio extracelular, especialmente en el periplasma, como consecuencia la

cantidad de agua intracelular disminuye. A medida que se pierde el agua de la célula, la vacuola se contrae progresivamente, con una caída concomitante en la turgencia celular, lo que lleva a una plasmólisis entre el protopasto y la pared celular. Por lo tanto, las plantas hiperhidratadas bajo condiciones de exceso de agua se encuentran en un estrés osmótico.

Igualmente, otros estudios concluyen que el incremento en la concentración de agar en el medio reduce la hiperhidratación, aunque este efecto implica un descenso de la tasa de multiplicación (Choudhary & Prakash 1993; Tsay, 1998). Por esta razón se sugiere que para mejorar los resultados, se debe limitar la síntesis foliar con retardantes de crecimiento y no intentar controlar la hiperhidratación en la fase de multiplicación. El desarrollo foliar se debe permitir luego de esta etapa (Ziv, 1991). Esto se apoya en la conclusión de Leshem (1983) que afirma que el estado hiperhídrico de las plantas puede ser reversible.

6.2.3 Fase de Enraizamiento in vitro

En la fase de enraizamiento in vitro se calculó la presencia o ausencia de raíces en los brotes. Los resultados obtenidos muestran que con los 3 tratamientos evaluados se presentaron brotes con desarrollo de raíces en las cinco de variedades. La capacidad que tienen las plantas en condiciones in vitro para la producción de raíces adventicias parece estar relacionada con la

revigorización (“rejuvenecimiento”) del material vegetal. Hartmann et al.,

(1997) señalan que el incremento en la inducción de raíces in vitro esta relacionado con la reversión a un estado juvenil logrado por el aumento en el número de subcultivos.

Complementando este planteamiento Sánchez – Olate et al., (2004) afirman que el aumento del potencial de enraizamiento puede persistir luego de la micropropagación. Dichas plantas producidas en condiciones in vitro pueden ser muy útiles como plantas madres para la producción de esquejes por métodos convencionales.

En el caso concreto del clavel, el establecimiento de plantas madres se debe realizar solamente con esquejes enraizados y vigorosos (Pizano, 2000). Basándose en este planteamiento la revigorización (“rejuvenecimiento”) de los tejidos in vitro relacionado con un incremento en el potencial de enraizamiento de los tejidos cultivados, puede ser conveniente en el momento de sembrar las plantas madres.

En el control (MS – sin reguladores de crecimiento) la variedad White Sim presentó el mayor porcentaje de brotes que desarrollaron raíces (64.3%), al igual que con el tratamiento 1 (MS/2 – sin reguladores de crecimiento) (61.5 %). Mientras que con el tratamiento 2 (MS/2 – 1 ppm de AIA) el mayor porcentaje de brotes que desarrollaron raíces lo obtuvo la variedad Picote Vanesa con un valor de 81.8 %. Este fue el valor más alto de todos los tratamientos y variedades (Figura 18).

0,0% 10,0% 20,0% 30,0% 40,0% 50,0% 60,0% 70,0% 80,0% 90,0%

Presente Ausente Presente Ausente Presente Ausente

Control T1 T2

% B

ro

te

s

Mercedes Picote Vanesa White Sim

Figura 18. Efecto de la concentración del medio de cultivo y del AIA sobre el desarrollo de raíces (%) en las variedades: Mercedes, Picote Vanesa y White Sim.

Estos resultados muestran que la respuesta al tratamiento depende de la variedad. El porcentaje más alto en el desarrollo de raíces por variedad difirió en los tratamientos evaluados. Las variedades Mercedes y Picote Vanesa presentaron los porcentajes más altos en el desarrollo de raíces en el tratamiento de MS/2 con 1 ppm de ácido indolacético (AIA) (54.5 y 81.8 %, respectivamente) (Figura 19). Oliver – Ortega et al., (2000) reportan que en el enraizamiento in vitro, se ha observado que la iniciación de raíz y la posibilidad de enraizamiento pueden aumentar de manera significativa al disminuir los niveles de sales minerales en el medio nutritivo, lo cual mejora el enraizamiento y la aclimatación en invernadero. La concentración de AIA también influyó en los resultados, Toro (2004) reporta un 70,8 % en la formación de raíces en Prunus avium; sin embargo el desarrollo de la relación raíz – parte área, fue muy bajo repercutiendo en la aclimatación del material.

0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90%

Mercedes Picote Vanesa White Sim

% B

ro

te

s

Control T1 T2

Figura 19. Comparación del efecto de los tratamientos aplicados para la inducción de raíces in vitro para cada variedad.

Contrario a estos resultados la variedad White Sim no mostró diferencias con respecto a la formación de raíces con ninguno de los tratamientos evaluados, lo que sugiere que esta variedad no requiere auxinas exógenas para la producción de raíces. Esto coincide con el estudio realizado por Cuzzuol et al., (1996) que concluyen que el enraizamiento de clavel puede ser obtenido sin la necesidad de suplementar el medio con auxinas. Este resultado puede ser atribuido aparentemente por la producción de auxinas endógenas en la planta. De acuerdo con Col et al., (1988) las partes aéreas, principalmente las hojas fuentes, tienen una producción intensa de auxinas que pueden ser translocadas a la base para estimular la rizogénesis.

Adicionalmente, estos autores describen que el enraizamiento ex vitro puede presentar mejores resultados con relación al enraizamiento in vitro. El desarrollo de raíces en condiciones ex vitro puede producir un sistema radical más completo y funcional con mayor número de raíces secundarias. Además se sugiere que el enraizamiento en condiciones in vitro puede presentar desventajas tales como: un sistema radical no funcional, mayores probabilidades de contraer enfermedades durante el transplante y conexiones limitadas del sistema vascular entre el tallo y la raíz. (Debergh &

Read, 1991). Todo esto se ve reflejado en la supervivencia y desarrollo de las plantas durante la aclimatización.