Cinética de extinción de la memoria de trabajo en

2.5.2.1. Procedimiento

En esta sección se investigó el proceso de extinción de la memoria de trabajo en progreso durante el mapéo cognoscitivo mediante el paradigma descrito por Beatty y Shavalia (1980); utilizando los mismos sujetos experimentales de la sección anterior, los cuales durante los últimos 15 ensayos alcanzaron y mantuvieron un nivel estable en las calificaciones obtenidas en la tarea conductual (consolidación). El esquema de tratamiento farmacológico, para los tres grupos de estudio, se continuó ininterrumpidamente (durante los 33 días que duró esta serie experimental). Al inicio de ésta sección, el peso corporal promedio de todos los sujetos experimentales fue de 202 g.

El ensayo consistió en sujetar a cada rata a un periodo de retardo entre la cuarta y quinta elecciones de los brazos del laberinto radial elevado de ocho brazos, bajo la estrategia acierto-cambio anteriormente descrito. Los periodos de retardo que se ensayaron fueron de: 1, 5, 15, 30, 60, 120, 240, 480, 720, y 1440 minutos; y para cada tiempo de retención se realizaron 3 ensayos en días consecutivos. Durante el periodo de retardo los sujetos fueron mantenidos en una caja de acrílico. Los receptáculos de todos los brazos fueron nuevamente cebados (Froots loops,

Kellog’s, como reforzador positivo) antes de que cada sujeto experimental diera comienzo a las elecciones 5-8. Los experimentos se llevarán a cabo iniciando los ensayos conductuales a las 9 horas.

2.5.2.2. Análisis de resultados

De acuerdo al trabajo de Beatty y Shavalia (1980), los agentes farmacológicos que afectan un proceso esencial y específico de la memoria de trabajo, deberán causar que el sujeto vuelva a elegir uno de los brazos del laberinto visitados durante las primeras cuatro elecciones; pero de la quinta a la octava elección (después de un periodo de retardo dado), el sujeto no deberá de repetir un brazo no visitado durante las primeras cuatro elecciones. En sujetos no entrenados previamente, el porcentaje de aciertos esperados probabilisticamente (al azar) es del 45 %. De tal suerte que, en ésta serie experimental, tanto la cinética de la extinción de memoria de trabajo como la integridad motora, fueron evaluadas considerando los siguientes parámetros:

• Latencia: Tiempo (expresado en segundos) requerido por cada sujeto experimental para dar inicio a la quinta elección, a partir del momento en que es colocado en la plataforma central del laberinto radial, (después del periodo de

• Tiempo de ejecución: Tiempo (expresado en segundos) requerido en un ensayo para llevar a cabo de la quinta a la octava elecciones.

• Calificación: Número de brazos no repetidos de la quinta a la octava elecciones; ó bien, el número de elecciones correctas en 10 min.

Al igual que en la primera sección experimental, los datos obtenidos para los tres parámetros estudiados fueron sujetos a un análisis estadístico, obteniéndose la media aritmética (por grupo, por ensayo) y el error estándar de la media (SEM). Para determinar la diferencia entre los resultados obtenidos por ensayo de los grupos tratados con respecto al grupo testigo, se utilizó la prueba de comparación múltiple pareada de Dunnett, con un criterio de P < 0.05. La captura de datos experimentales, así como su análisis y presentación gráfica, se llevó a cabo mediante los programas SigmaPlot y SigmaStat para Windows 95 (Jandel Scientific).

CAPITULO III

R E S U L T A D O S

1. EFECTO DE HEPB SOBRE LOS pEPSPs INDUCIDOS POR ESTIMULACIÓN DE LA VÍA COLATERALES DE SCHAFFER-CÉLULAS

PIRAMIDALES CA1 DEL HIPOCAMPO DE IA RATA IN VITRO

En FCEA normal (condiciones control) el registro de campo (extracelular, en un volumen conductor dado por el medio de incubación, el cual es utilizado como referencia eléctrica) de los potenciales pos-sinápticos excitatorios poblacionales (pEPSPs) inducidos por estimulación de la vía colaterales de Schaffer-células piramidales CA1, en laminillas sagitales del hipocampo de la rata, resultó consistentemente en eventos electrofisiológicos caracterizados por (fig. 8, panel superior izquierdo): 1) Un primer evento correspondiente al artefacto de estimulación; 2) Una primera deflexión transientes positiva, con una amplitud de 20- 80 µV y una duración de aproximadamente 0.5 ms, correspondiente a la descarga

aferente de las colaterales de Schaffer; y 3) Una segunda deflexión positiva, con una amplitud máxima de 0.4 a 0.8 mV y una duración de 6 a 9 ms, correspondiente a los pEPSPs generados en las dendritas apicales de las células piramidales.

Los pEPSPs registrados en condiciones control, alcanzaron una magnitud estable dentro de los primeros 30 min de registro, obteniéndose valores de 0.073 a 0.181 mV/ms para la pendiente de la primera fase de dichos eventos.

La perfusión de HEPB (200 µM) en el medio de incubación, por un periodo de

30 min, resultó en un aumento paulatino en la magnitud de los pEPSPs, alcanzando un incremento máximo en la pendiente del 34.3 ± 4.25 % (n=4), con respecto a la magnitud basal, 30 minutos posterior al inicio de la aplicación del fármaco (fig. 8, panel inferior), y retornando a valores control entre 82 y 115 min después de retirar HEPB del medio de perfusión. La potenciación de los pEPSPs ejercida por HEPB se presentó sin cambios en la magnitud de la descarga aferente de las colaterales de Schaffer (fig. 8, panel superior).

Fig. 8. Efecto de HEPB sobre los pEPSPs inducidos por activación de la vía colaterales de Schaffer-células piramidales CA1, en el hipocampo de la rata in vitro. Cada uno de los trazos mostrados en el panel superior corresponde al promedio digital de 15 pEPSPs, registrados inmediatamente antes de la perfusión de HEPB (Control), 30 min después iniciar su aplicación (HEPB), y 150 min después de retirarlo del perfusado (Lavado). En el panel inferior se muestra el curso temporal de los efectos de HEPB sobre la pendiente de los pEPSPs, expresada como % del valor obtenido inmediatamente antes de iniciar la aplicación del fármaco. Cada punto representa la media aritmética (± error estándar) de los valores obtenidos en cuatro ensayos experimentales independientes.

2. EFECTO DE HEPB SOBRE LTP INDUCIDA POR ESTIMULACIÓN

TETÁNICA DE LA VÍA COLATERALES DE SCHAFFER-CÉLULAS

PIRAMIDALES CA1 DEL HIPOCAMPO DE LA RATA IN VITRO

En ausencia de HEPB, la estimulación tetánica de las colaterales de Schaffer indujo un incremento en la magnitud de los pEPSPs generados en las dendritas apicales de las células piramidales CA1, con una cinética característica del fenómeno de potenciación sináptica de largo término (LTP). El incremento en la pendiente de los pEPSPs alcanzó un valor máximo del 49 ± 7.8 % (n=6), con respecto al registro basal (fig. 9., primer trazo en el panel superior), dentro de los primeros 10 min posteriores a la estimulación tetánica (fig. 9, segundo registro en panel superior y primer Tet en el panel inferior). Después de que la magnitud de los pEPSPs retornó a valores control (80 a 95 min), la perfusión continua de HEPB (200

µM) per se, indujo una potenciación sináptica sostenida del 26.2 ± 5.9 % (fig. 9.,

tercer trazo en panel superior y HEPB en el panel inferior). En éstas circunstancias (presencia de HEPB en el medio de perfusión), una segunda estimulación tetánica indujo un incremento ulterior en la magnitud de los pEPSPs (fig. 9., cuarto trazo en panel superior y segundo Tet en panel inferior) con un curso temporal inicial y una potenciación máxima (46.3 ± 8.1%, con respecto a la magnitud basal de los pEPSPs en ausencia del fármaco) similares a los obtenidos en ausencia de HEPB, pero con una prolongación significativa (P< 0.05, t de Student) en la fase sostenida de

presencia de HEPB). Después de 140 min de remover el fármaco del medio de incubación se observó una recuperación en la magnitud basal de los potenciales pos-sinápticos excitatorios poblacionales.

Bajo ninguna de las manipulaciones experimentales (estimulación tetánica y/ó presencia de HEPB) se presentaron cambios en la magnitud de la descarga aferente de las colaterales de Schaffer (fig. 9, panel superior).

Fig. 9. Efecto de HEPB sobre LTP inducida por estimulación tetánica de la vía colaterales de Schaffer-células piramidales CA1, en el hipocampo de la rata in vitro. En el panel superior se muestra el promedio digital de 15 pEPSPs registrados en: Condiciones Control; Máxima potenciación inducida por estimulación tetánica (Tet); Treinta min después iniciar la perfusión continua de HEPB; y, Máxima potenciación inducida por estimulación tetánica en presencia de HEPB (HEPB + Tet). En el panel inferior se observa el curso temporal de los efectos inducidos por las manipulaciones experimentales antes señaladas sobre la’ pendiente de los pEPSPs, expresándose como % del valor obtenido en condiciones basales. El retiro de HEPB del medio de perfusión es señalado por FCEA. Cada punto representa la media aritmética (± error estándar) de los valores obtenidos en seis

3. EFECTO DE HEPB Y DE FENOBARBITAL SOBRE LOS PROCESOS DE ADQUISICIÓN Y CONSOLIDACIÓN DE INFORMACIÓN ESPACIAL

EN LA RATA IN VIVO

En esta investigación se analizó en primer término el efecto de HEPB (50 mg/kg) y de fenobarbital (60 mg/kg) sobre los parámetros temporales de la tarea espacial estudiada. En los animales que fueron tratados únicamente con el vehículo (grupo testigo) el tiempo requerido por cada sujeto experimental para dar inicio a la tarea espacial, desde que es colocado en la plataforma central del laberinto radial hasta elegir el primer brazo (latencia), se redujo con ensayos subsecuentes desde valores aproximados de 1 min, en el primer ensayo, hasta menos de 10 s a partir del décimo noveno ensayo. Este último valor se mantuvo constante en ensayos posteriores. El grupo tratado con HEPB no mostró diferencias significativas con respecto al grupo testigo. Sin embargo, en el grupo tratado con fenobarbital se presentaron diferencias significativas (P < 0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza) con respecto al grupo testigo, las cuales resultaron en latencias tanto mayores (ensayos: 1, 3, 7, 11, y 14) como menores (ensayos: 6 y 8) (fig. 10).

El tiempo de resolución de la tarea espacial también fue reduciéndose paulatinamente en ensayos subsecuentes, tanto en el grupo testigo como en los grupos tratados con los fármacos anticonvulsivantes (fig. 11). Los valores obtenidos en el primer ensayo fueron de aproximadamente 450 s, y los del último ensayo (33)

Fig. 10. Análisis neuropsicofarmacológico comparativo de los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre la latencia de inicio de la tarea espacial (desde que los sujetos fueron colocados en la plataforma central del laberinto radial hasta la elección del primer brazo) durante el proceso de adquisición y consolidación de información espacial en la rata. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida por grupo por ensayo (n=8). * P< 0.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza).

Fig. 11. Análisis neuropsicofarmacológico comparativo de los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre el tiempo de resolución de la tarea, durante el proceso de adquisición y consolidación de información espacial en la rata. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida por grupo y por ensayo (n=8). * P<0.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza).

de inicio, el tiempo de resolución de la tarea estudiada no fue afectado significativamente por la administración de HEPB; mientras que en el grupo tratado con fenobarbital los tiempos de resolución obtenidos fueron consistentemente menores a los obtenidos para el grupo testigo, encontrándose diferencias significativas (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza) en los ensayos 9,15, 23, 26, y 33.

En el grupo testigo, el análisis del proceso de adquisición de la información espacial mostró que a partir del décimo quinto día de ensayo se alcanzó un nivel máximo estable de aprendizaje (consolidación), resultando en un porcentaje de aciertos mayor del 97% (fig. 12). Los sujetos tratados con HEPB siguieron un proceso de adquisición paralelo al del grupo testigo, y aunque en ninguno de los 33 días de ensayo se presentaron diferencias significativas (F-0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza sobre rangos de Kruskal- Wallis) con respecto a las calificaciones obtenidas por el grupo testigo, el grupo tratado con HEPB mantuvo calificaciones perfectas (8 aciertos = 100%) a partir del ensayo 23. En contraste, el grupo tratado con fenobarbital mostró un deterioro significativo (P < 0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza sobre rangos de Kruskal-Wallis), con respecto al grupo testigo, en el aprendizaje de información espacial a partir del noveno ensayo; resultando en un nivel de consolidación que osciló entre el 85 y 90 % de aciertos a partir del ensayo

Fig. 12. Análisis neuropsicofarmacólogico comparativo entre los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre el proceso de adquisición y consolidación de información espacial en la rata. Los fármacos fueron administrados (i.p.) cada 24 h durante un periodo de 33 días continuos! a partir de ocho días antes de iniciar los ensayos conductuales. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida para la calificación (expresada como porcentaje de aciertos) por grupo y por ensayo (n = 8). * P<4.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza sobre rangos de Kruskal-Wallis).

4. EFECTO DE HEPB Y DE FENOBARBITAL SOBRE LA MEMORIA

DE TRABAJO EN PROGRESO DURANTE EL ANÁLISIS DE

INFORMACIÓN ESPACIAL EN LA RATA IN VIVO

Al día siguiente del último ensayo (33) del periodo de adquisición y consolidación de información espacial, los tres grupos de sujetos fueron sometidos al paradigma conductual descrito por Beatty y Shavalia (1980), con el objetivo de investigar comparativamente la acción de HEPB (50 mg/kg) y de fenobarbital (60 mg/kg) sobre la memoria de trabajo (funcional) en progreso durante el mapéo cognoscitivo

El curso temporal de la extinción de la memoria de trabajo obtenido para el grupo testigo, mostró que el número de aciertos logrados por los sujetos entre la 5a y 8a elecciones fue mayor del 90 % después de intervalos crecientes de retardo (entre la 4a y 5a elecciones) de 1 a 240 min; disminuyendo dicho porcentaje de aciertos hasta el 41 % con intervalos de retardo de 24 h (1440 min, fig. 13). En el grupo tratado con HEPB la cinética de extinción de la memoria de trabajo siguió un curso similar al observado para el grupo testigo hasta el intervalo de retardo de 8 h (480 min); sin embargo, con retardos de 12 y 24 h el grupo tratado con HEPB mostró diferencias significativas (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza sobre rangos de Kruskal-Wallis), obteniendo 87.5 ± 4.8 % y

Fig. 13. Análisis neuropsicofarmacólogico comparativo entre los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre el procesa de extinción de la memoria de trabajo en progreso durante el análisis de información espacial en la rata. Los fármacos fueron administrados (i.p.) cada 24 h durante los 30 días de ésta investigación y previamente durante 41 días continuos. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida para la calificación {expresada como porcentaje de aciertos) por grupo durante tres días en que se realizaron ensayos con el mismo intervalo de retardo (n=24). * P<0.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza sobre rangos de Kruskal-Wallis).

40.8 ± 0.8 % (respectivamente) de aciertos para el grupo testigo. En contraste, con intervalos de retardo de 1 a 240 min el grupo tratado con fenobarbital mostró en forma consistente un deterioro significativo (con respecto al grupo testigo) sobre la memoria de trabajo, resultando en aciertos en el intervalo del 84.5 al 68.8 %, lo cual fue equivalente a la extinción que los sujetos del grupo testigo sufrieron después de 8 h mostrando el 72 ± 3.3 % de aciertos.

El análisis de los parámetros temporales de la tarea espacial estudiada, mostró que para el grupo testigo las latencias se redujeron desde valores de 6.5 ± 1.2 s con un intervalo de retardo de 1 min, hasta 2.1 ± 0.5 s con 24 h de retardo (fig. 14). Los valores obtenidos para el grupo tratado con HEPB siguieron un curso temporal similar al del grupo testigo, resultando en latencias de 6.7 ± 1.2 s con un ruin de retardo y de 2.3 ± 0.5 s con 24 h de retardo, no existiendo diferencias significativas entre los valores obtenidos para ambos grupos a ningún intervalo de retardo estudiado (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza). A excepción del valor obtenido (9.4 ± 5.2 s) con un min de retardo, el grupo tratado con fenobarbital mostró latencias menores a las obtenidas por el grupo testigo, resultando en diferencias significativas con retardos de 15, 30, y 120 min (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza). Los tiempos de resolución obtenidos tampoco mostraron diferencias significativas entre el grupo testigo y el grupo tratado con HEPB (fig. 15), resultando en valores de

Fig. 14. Análisis neuropsicofarmacológico comparativo entre los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre fa latencia de inicio de la tarea espacial (desde que los sujetos fueron colocados en la plataforma central del laberinto radial hasta la elección del primer brazo) durante el proceso de extinción de la memoria de trabajo en progreso durante el análisis de información espacial en la rata. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida por grupo por ensayo (n=8). * P<0.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza).

fenobarbital resultaron significativamente menores que los obtenidos por el grupo testigo (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza), con valores que disminuyeron desde 76 ± 7.7 s con un intervalo de retardo de 1 min, hasta 48 ± 5.3 s con un retardo de 24 h.

Fig. 15. Análisis neuropsicofarmacológico comparativo entre los efectos de HEPB y de fenobarbital sobre el tiempo de resolución de la tarea, durante el proceso de extinción de la memoria de trabajo en progreso durante el análisis de información espacial en la rata. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar) obtenida por grupo y por ensayo (n=8). * P<0.05 (comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza).

5. ANÁLISIS DE PESOS CORPORALES

Con el objetivo de llevar a cabo un control continuo sobre el estado nutricional de los sujetos experimentales utilizados en éste estudio, se llevó a cabo el registro del peso corporal durante 79 días, a partir de 8 días antes de iniciar el tratamiento farmacológico (fig. 16). Dentro de los primeros 8 días de dar inició a la alimentación restringida, todos los sujetos sufrieron una leve disminución de peso corporal, registrándose una pérdida del 3.9 % tanto para el grupo testigo (de 129.6 ± 4.8 a 124.6 ± 4.8 g) como para el grupo posteriormente tratado con HEPB (de 123.1 ± 4.1 a 118.4 ± 3.6 g); mientras que en el grupo posteriormente tratado con fenobarbital el peso corporal disminuyó en 5.6 % (de 114.6 ± 3.4 a 108.2 ± 3.7 g) existiendo diferencias significativas con respecto al grupo testigo durante dicho periodo (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett. previo análisis de varianza). Sin embargo, a partir del primer día de tratamiento farmacológico (día 9) y hasta el último día de ensayo conductual (día 79), los tres grupos presentaron una ganancia sostenida en el peso corporal; no existiendo diferencias significativas entre los grupos que recibieron los fármacos y el grupo testigo (P<0.05, comparación múltiple pareada de Dunnett, previo análisis de varianza). Al final de ésta investigación los pesos corporales fueron de: 228 ± 12.5 g para el grupo testigo; 216.6 ± 10.8 g para el grupo tratado con HEPB; y de 224 ± 9.1 g para el grupo tratado con fenobarbital.

Fig. 16. Curso temporal del incremento ponderal de los sujetos experimentales utilizados en el análisis neuropsicofarmacológico comparativo, entre el efecto de HEPB y de fenobarbital, sobre el proceso de extinción de la memoria de trabajo en proceso durante el análisis de información espacial en la rata. Los puntos experimentales representan la media aritmética (± error estándar, n = 8) obtenida para el peso corporal (expresado en gramos) por grupo, durante 79 días continuos a partir de 8 días previos al inicio del tratamiento farmacológico, y 16 días antes de iniciar el ensayo conductual.

CAPITULO IV

D I S C U S I Ó N

1. HEPB INDUCE LTP EN LA VÍA COLATERALES DE

SCHAFFER-CÉLULAS PIRAMIDALES CA1 DEL

HIPOCAMPO DE LA RATA IN VITRO

El primer objetivo planteado en la presente investigación, fue el de determinar electrofisiológicamente la acción de HEPB sobre los mecanismos sinápticos que participan (Davis y col., 1992) en los procesos de aprendizaje y memoria de información espacial en el hipocampo de la rata.

Nuestros resultados muestran que HEPB induce un incremento significativo en la magnitud de los potenciales pos-sinápticos excitatorios poblacionales (pEPSPs), activados por estimulación de la vía colaterales de Schaffer-células piramidales CA1. Si bien, el establecimiento de la potenciación sináptica inducida por éste anticonvulsivante se desarrolla paulatinamente, alcanzando un valor máximo 30 min después de iniciar la aplicación del fármaco, dicha potenciación se prolonga por el término de más de una hora después de retirar HEPB del medio de perfusión. El trabajo original de Bliss y Lamo (1973), señala que en sinapsis integrativas del sistema nervioso central, el mecanismo a través del cual se produce y mantiene un incremento en la fuerza (eficiencia) sináptica es la potenciación de largo término (LTP). Este fenómeno difiere de otros mecanismos de plasticidad