4.3 Las cuatro saponinas triterpenoides C1, C2, C3 y C4 aisladas de la fracción EF-3 de Ectyoplasia ferox no tienen
4.3.2 Citotoxicidad mediante el ensayo de hemólisis
Se realizó la prueba de hemólisis para evaluar el efecto de las saponinas triterpenoides en la membrana celular de eritrocitos humanos. En general, los porcentajes de hemólisis obtenidos no superan el 50% incluso con la concentración 200 µM (Figura 15), sin embargo, el compuesto 4 exhibió un 43% de hemólisis.
Figura 15. Efecto hemolítico de cuatro saponinas triterpenoides aisladas de la esponja
Ectyoplasia ferox en eritrocitos humanos. Las barras representan los porcentajes de hemólisis
obtenidos luego de exponer eritrocitos humanos durante 1 hora a 100 ó 200 µM de los compuestos C1 (ulosósido F), C2 (urabósido A), C3 (urabósido B) y C4 (ulolósido A). Los valores de la media se obtuvieron a partir de 4 repeticiones en 1 único experimento. Las barras de error indican el error estándar de la media. 100 200 0 10 20 30 40 50 60 70 80 C1 C2 C3 C4 M % He m ó li s is
5
Discusión
En este trabajo, se evaluó la actividad citotóxica y antiproliferativa de cuatro fracciones y cuatro compuestos puros (saponinas triterpenoides) aislados a partir de la esponja marina
Ectyoplasia ferox, colectada en el Golfo de Urabá. En primer lugar, los ensayos in vitro
permitieron evaluar la actividad citotóxica (Pruebas de MTT, azul de tripano y hemólisis) y antiproliferativa (eficiencia de clonación y función de acumulación) en dos líneas celulares, la línea leucemoide humana (Jurkat) y la línea celular murina establecida (CHO). Luego, evaluamos la actividad hemolítica en eritrocitos humanos para determinar el nivel de toxicidad de los compuestos puros, un parámetro importante, teniendo en cuenta que éste es el principal obstáculo en los ensayos clínicos 51.
Existe amplia evidencia que los organismos marinos contienen innumerables compuestos activos antitumorales y las esponjas marinas son de particular interés, debido a la gran variedad de compuestos que se han aislado tales como, alcaloides, esteroides, saponinas, terpenos, péptidos, macrólidos y policétidos, entre otros, con potente actividad citotóxica (IC50 < 10 µM). En este trabajo se encontró que la fracción polar denominada EF-3 obtenida de la esponja marina Ectyoplasia ferox tenía una actividad citotóxica significativa en las líneas celulares CHO y Jurkat (IC50 = 48 μg/mL en células CHO e IC50 = 38 μg/mL en
células Jurkat). Otras fracciones como la EF-6, EF-7 y EF-8 que presentaban una composición mixta de moléculas de tipo polar y apolar, exhibieron un efecto citotóxico bajo en las dos líneas celulares, siendo la fracción EF-6 la que mostró mayor efecto comparado al de las fracciones EF-7 y EF-8. Estos resultados son consistentes, con la presencia de sustancias de naturaleza polar en la fracción EF-6 tales como, polisacáridos, saponinas y glicolípidos, similares a los de la fracción EF-3 (ver Materiales y Métodos). Por otro lado, las fracciones EF-7 y EF-8 mostraron dos tipos de sustancias polares, tales como polisacáridos, saponinas y glicolípidos y de otro lado, ácidos grasos libres y triglicéridos. Estos componentes también se evidenciaron en el momento de preparar las muestras para los bioensayos puesto que las fracciones EF-7 y EF-8 mostraron menos solubilidad en los solventes usados que las fracciones EF-3 y EF-6. No descartamos la existencia de sustancias bioactivas en estas fracciones, en cambio creemos que es probable que las fracciones EF-7 y EF-8 contengan sustancias bioactivas que actuarían a nivel intracelular y que la ausencia de actividad citotóxica observada seria una consecuencia de que los
compuestos presentes en estas fracciones no atravesaran la membrana celular. Este planteamiento podría comprobarse si se estudiara en profundidad la actividad citotóxica de compuestos aislados de estas fracciones.
En continuidad con nuestro razonamiento experimental, se seleccionó la fracción EF-3 para continuar el análisis de la actividad citotóxica y antiproliferativa. Los resultados de la prueba de eficiencia de clonación y función de acumulación mostraron que la fracción EF-3 afecta moderadamente la progresión del ciclo de las líneas celulares CHO y Jurkat, siendo las CHO, más sensibles al efecto antiproliferativo. Estos resultados, evidencian las diferencias genéticas entre las dos líneas celulares, por ejemplo, en las células Jurkat, el gen que codifica la proteína p53 está mutado, por lo tanto, las células con daño en su DNA, no serían detenidas en la fase G2, pudiendo continuar a otras fases del ciclo celular 52, mientras que en las células CHO se expresa normalmente el gen p53, causando detención de las células en la fase G2 para reparar el daño genético o la revisión de la continuidad del ciclo celular causada de la fracción EF-3 a bajas concentraciones (24 μg/mL).
El efecto de la fracción EF-3 sobre el ciclo celular, también fue analizado mediante la prueba de Intercambio de Cromátidas Hermanas en células CHO y Jurkat. Las células fueron tratadas con una concentración equivalente a la IC25 de la fracción, sin embargo en las
placas obtenidas no se encontró un número adecuado (20-25) de metafases de primero, segundo o tercer ciclo que permitieran evaluar la progresión del ciclo (datos no presentados). Aunque estas observaciones deben repetirse, los datos preliminares nos permiten especular que la fracción EF-3 causaría la detención del ciclo celular.
Los resultados del análisis de la composición química de la fracción EF-3 21, 34 concuerdan con los estudios existentes de la composición química de la esponja marina Ectyoplasia
ferox, donde muestran que sus mayores componentes son compuestos tipo saponinas
triterpenoides (ectyoplásidos y feróxidos) 18, 26, 53 . Las saponinas, son glicósidos triterpenoides o esteroides con propiedades surfactantes naturales, ampliamente distribuidos en plantas y organismos marinos, en especial, las saponinas triterpenoides (C30) han mostrado tener potentes propiedades antitumorales 54-58. La actividad citotóxica de estas moléculas se ha asociado con sus propiedades anfilíticas, basados en su esqueleto
hidrofóbico de aglicona y una o dos fracciones hidrofílicas ramificadas, unidas a la aglicona. Las saponinas triterpenoides disminuyen la tensión superficial de las soluciones acuosas y en altas concentraciones logran crear huecos en las membranas celulares 59. Se propone que este efecto se basa en la asociación de la aglicona con el colesterol 23.
La citotoxicidad moderada que exhibió la fracción EF-3 en las dos líneas celulares (IC50 = 48
μg/mL en células CHO y IC50 = 38 μg/mL en células Jurkat) concuerda con la moderada actividad citotóxica descrita previamente para glicósidos triterpenoides de Ectyoplasia ferox en líneas celulares J774 (macrófagos-monocitos murinos), WEHI164 (fibrosarcoma murino), y P388 (leucemia murina) en las que se determinaron valores para la IC50 de 8,5 hasta 19
μg/mL17, 18. Sin embargo, las cuatro saponinas triterpenoides aisladas no mostraron efecto
citotóxico significativo en las dos líneas celulares (IC50 > 100 μM), lo cual podría explicarse
por las diferencias estructurales presentadas en la fracción hidrofóbica de los compuestos
C1, C2 y C3 respecto a las reportadas para otros furanóxidos y ectyoplásidos, en los que se
resalta la importancia de la presencia de la fracción hidrofóbica (aglicona) en la actividad citotóxica 60, 61.
La prueba de la actividad hemolítica de la fracción EF-3 mostró que la citotoxicidad evaluada por MTT no está mediada por daño en la membrana celular, aún con concentraciones de 100 μg/mL. La misma prueba en las cuatro saponinas reveló un porcentaje de hemólisis mayor al 50% en concentraciones mayores a 100 µM, siendo similares a los resultados de la fracción. Estos resultados resultan muy interesantes teniendo en cuenta que las moléculas candidatas a fármacos deben presentar una baja actividad hemolítica para ser aprobadas en las pruebas clínicas 51, 62-65 . En estas pruebas, la vía de administración intravenosa de una sustancia con alta actividad hemolítica puede inducir muerte de las células de la sangre y causar efectos secundarios graves, además influyen drásticamente en la decisión de los pacientes para abandonar la quimioterapia 66, 67.
Los resultados de la prueba de MTT demuestran que las cuatro saponinas triterpenoides no tienen actividad citotóxica, sin embargo debemos tener en cuenta que las saponinas triterpenoides son sustancias complejas y susceptibles a hidrólisis del enlace glicosídico, entonces la alteración de la estabilidad química de estos compuestos durante el almacenamiento y la manipulación explicaría la ausencia de actividad citotóxica y hemolítica
en nuestros bioensayos. Esta explicación, es muy probable teniendo en cuenta el hecho de que la prueba de hemólisis de la fracción EF-3 se realizó varios meses después de haber realizado las pruebas de citotoxicidad. Por otro lado, asumiendo que la fracción y los compuestos fueran estables, es probable que ninguna de las saponinas caracterizadas este asociada con la actividad citotóxica observada para la fracción EF-3, aceptando esta explicación es posible que estos compuestos no estén presentes en la fracción o que si lo están, su concentración sea muy baja. Estas posibles explicaciones también deben tenerse en cuenta en futuros estudios químicos y de actividad biológica de estos compuestos.
A pesar de que el mecanismo de acción de las saponinas no está bien entendido, en los dos últimos años, se han propuesto algunos mecanismos de acción de varias saponinas triterpenoides aisladas de plantas. La mayoría de estudios, coinciden en que las saponinas triterpenoides son agentes proapoptóticos y buenos candidatos para el desarrollo de fármacos y para ser usadas en nuevas terapias antitumorales 58, como lo es la mediación de la liberación especifica de toxinas quimioterapéuticas en células tumorales 68. Es necesario evaluar en estudios posteriores, si la actividad citotóxica que exhibió la fracción EF-3 en las dos líneas celulares CHO y Jurkat estaría mediada por la activación de la apoptosis.
En resumen, los resultados presentados resaltan el potencial bioactivo de las saponinas triterpenoides en una fracción metanólica de la esponja marina Ectyoplasia ferox. Este trabajo aporta una nueva confirmación de que las saponinas triterpenoides están presentes de forma abundante en las esponjas marinas pertenecientes al orden Poecilosclerida. Los resultados de la evaluación de la actividad citotóxica de las saponinas triterpenoides demostraron que se debe realizar los bioensayos inmediatamente se aíslen los compuestos con el fin de no causar daño a la estabilidad química de las saponinas triterpenoides por los protocolos de congelación o almacenamiento a largo plazo. En este estudio, ninguna de las cuatro saponinas triterpenoides estudiadas, presentó una actividad citotóxica similar a la observada para la fracción metanólica EF-3. Estos resultados motivan estudios químicos y de actividad biológica adicionales de éstos y otros compuestos.
6
Conclusiones
– La fracción metanólica EF-3 obtenida de la esponja Ectyoplasia ferox tiene una actividad citotóxica fuerte en las dos líneas celulares (IC50 = 48 μg/mL en c lulas
CHO y IC50 = 38 μg/mL en c lulas Jurkat).
–
Las fracciones EF-6, EF-7 y EF8 obtenidas de la esponja Ectyoplasia ferox no presentan actividad citotóxica significativa en las líneas celulares CHO y Jurkat. Teniendo en cuenta la complejidad de las moléculas que contiene la esponjaEctyoplasia ferox no se descarta la presencia de sustancias bioactivas en estas
fracciones.
–
La fracción EF-3 tiene un efecto antiproliferativo moderado en las líneas celulares CHO y Jurkat.–
Las saponinas triterpenoides ulosósido F, urabósido A, urabósido B y ulolósido A aislados de la fracción metanólica EF-3 de la esponja marina Ectyoplasia ferox no tienen actividad citotóxica en las líneas celulares CHO y Jurkat. De la misma forma estas saponinas no tienen actividad hemolítica en eritrocitos humanos.–
En su conjunto, nuestros resultados demuestran que la fracción metanólica EF-3 de la esponja marina Ectyoplasia ferox contiene moléculas tipo saponinas triterpenoides con actividad citotóxica y antiproliferativa.7
Recomendaciones
– Se recomienda continuar con la evaluación de la actividad citotóxica y antiproliferativa de otros compuestos puros obtenidos a partir de fracciones polares de la esponja
Ectyoplasia ferox con el fin de identificar el compuesto responsable del efecto
antiproliferativo observado en las dos líneas celulares.
– Se considera necesario evaluar el efecto genotóxico de la fracción EF-3 en concentraciones iguales o menores a la IC50.
– Se considera necesario evaluar el efecto citotóxico y antiproliferativo de la fracción EF-3 en otras líneas celulares.
– En general, se recomienda continuar evaluando fracciones orgánicas de la esponja marina Ectyoplasia ferox.
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