E coli como bacteria Modelo de estudio de Secreción de proteínas SSTT:

Translocación de proteínas en Escherichia coli:

Las proteínas sintetizadas en el citoplasma bacteriano están sometidas a una clasificación celular. Durante la biogénesis de las proteínas de membrana están catalizadas por factores celulares especializados (Bernstein, 2000). Los conocimientos citados a continuación permitieron que por estudios genómico – proteómico comparativos de E. coli con otras bacterias patógenas gram negativas de la Familia Enterobacteriaceae, conocer en un inicio en

Salmonella, la estructura y función de los sistemas de secresión de proteínas transportadoras: sistema inyector, proteínas de transporte y de las proteínas transportadas para formar parte de la estructura bacteriana, secretada hacia el medio exterior o para ser inyectada en la célula hospedadora.

 Exportación Sec- dependiente de un péptido señal.-

La translocación de las proteínas es llevada a cabo por “un mecanismo común” conservado entre las especies bacterianas, cuya ruta de exportación es dependiente del péptido señal (GEP). Ruta conocida como Sec dependiente (Wandersman, 1996) que presenta un aparato de exportación formado por 6 proteínas Sec que incluye a SecB (proteína citoplasmática), SecA, SecD, E, F, G y Y (localizadas en la membrana interna). Considerándose como subunidades esenciales a las 3 proteínas de membrana SecA (proteína ligada al lado de la membrana citoplásmica con actividad ATPásica sobre la unión entre la preproteína y los componentes de membrana del aparato de exportación, que proporciona energía para el proceso de exportación y produce un cambio conformacional en el complejo SecA-SecY-SecE), SecY (proteína

integral de membrana), y la proteína SecE (componente central del aparato de exportación, considerada de alguna manera como un “canal para la exportación”). Mientras que Sec B, D, F y G se las considera de carácter esencial para el crecimiento celular e incrementan la eficiencia de la translocación, posiblemente se estimule su actividad estando en el espacio periplasmático (William et al, 1994; Bernstein, 2000; Kajava et al, 2000), requerida ésta última para la “inserción de proteínas de membrana interna” que contengan grandes dominios periplásmicos, pero no para aquellos que presentan pequeños loops periplásmicos, las cuales requieren a SecE y que es exclusiva de bacterias. Estas proteínas tanto de membrana como periplásmicas presentan un péptido señal en su extremo amino, teniendo un importante papel en el proceso de la translocación de membrana (Economou A., 2000).

Sistema de secreción tipo II, las proteínas extracelulares que son exportadas por estos sistemas pueden o no requerir de proteínas auxiliares, que atraviesan la membrana interna gracias a la maquinaria Sec.

Sistema de secreción tipo V, utilizada por algunas proteínas gram negativas patógenas, denominadas proteínas autotransportadoras, como en el caso de IcsA (Shigella). Estas proteínas presentan la capacidad de mediar su propia translocación a través de la membrana externa después de haber sido transportada a través de la membrana interna vía Sec. Se caracterizan por presentar el dominio  en el extremo carboxilo, el que servirá de conexión con el dominio α de proteínas translocadas (Brandon y Goldberg, 2001; Henderson y Nataro, 2001). Aun existe controversias en considerárseles posiblemente de Tipo IV (Finlay y Falkow, 1997).

 Exportación Sec – independiente de un péptido señal.-

Sistema de secreción tipo I, utilizado por proteínas que atraviesan ambas membranas en un único paso “sin intermediarios periplasmáticos” cuya ruta está caracterizada por la presencia de ATPasas de membrana (obtienen energía a partir de la hidrólisis de ATP), denominadas familia ABC (proteínas de membrana citoplásmica, con un dominio hidrófobo inmerso en la membrana y un dominio citoplásmico conservado que incluye un sitio de unión a ATP, “ATP binding cassette”). Este sistema es altamente selectivo, lo que implica la presencia de señales de secreción comunes para las proteínas a exportar. Estas proteínas se caracterizan por no poseer una señal N-terminal, sino una señal de secreción localizada en los últimos 60 aminoácidos, donde C-terminal (Wandersman, 1996). “Este sistema reconoce el substrato a exportar en el lado citosólico de la membrana interna”, permitiendo: 1) La secreción directa al medio extracelular sin la formación de un intermediario periplasmático, y 2) La secreción de proteínas con enlaces disulfuro, que se forman específicamente durante el paso del polipéptido a través del canal de exportación. Recientemente se ha comprobado que este sistema tipo I, no solo permite la secreción de proteínas con enlaces disulfuro, sino que también puede permitir la formación de estos durante el paso a través del canal de exportación. Esta oxidación es independiente de la catálisis de óxido reductasas de puentes disulfuro TDOR pertenecientes a la familia Dsb, proteínas que pueden catalizar estos puentes en sustratos con residuos de cisteína, pero translocados a través del Sistema Sec (Fernández y De Lorenzo, 2001).

El Sistema de secreción Tipo III (TTSS), facilita la translocación de proteínas extracelulares que pueden o no requerir de otras proteínas auxiliares que las ayuden en la secreción de su intermediario periplásmico. Proteínas que a su

vez, modulan e interfieren con funciones de la célula hospedadora para beneficio del patógeno. Este sistema presenta las siguientes características: a) ausencia de un péptido señal propio de la secreción Sec independiente, b) requerimiento de proteínas citosólicas específicas con actividad de chaperona, y c) requerimiento de una señal ambiental que normalmente derivada del contacto con la célula hospedadora, para su total activación. Los componentes estructurales del TTSS forman una estructura supramolecular denominada

“complejo de aguja”, este filamento puede actuar como una jeringa molecular

que directamente inyecta las proteínas efectoras dentro del citosol de la célula hospedadora por acoplamiento de la secreción proteica y de la translocación (Hayward et al, 2000; Galán y Bliska, 1996; Galán J. 2001). Se han determinado efectores de Salmonella en Islas de Patogenicidad (PAIS, “segmentos largos

de DNA presentes en genomas de patógenos bacterianos que codifican factores de virulencia”) que son expresados diferencialmente y translocados por sistemas de secreción tipo III. 5 PAIS han sido identificados en bacterias gram negativas. En Salmonella, se han descrito 6 PAIS y dos islas de patogenicidad SPI1 y SPI2 que codifican TTSS 1 y 2 respectivamente son esenciales para la expresión de determinantes de virulencia (Wattiau,1996). La isla de patogenicidad SPI 1, esencial en Salmonella enteritidis , está implicada a la interacción inicial de las bacterias con las células epiteliales que permiten la formación del “ruffling” en el punto de contacto con la membrana de la célula diana, lo que va ha favorecer la entrada de la bacteria por pinocitosis y a la mediación en la translocación de las proteínas efectoras dentro del citosol de células hospedadoras, como son de SpiB (SspB), SpiC (SspC) y SipD (SspD). Este sistema también se encuentra presente en otras bacterias patógenas, presentando Spi (en Salmonella) homología con Ipa en Shigella y Yop B,D asociada a chaperonas LcrV en Yersinia spp (Scherer et al, 2000). Mientras

que la segunda Isla de patogenicidad SPI 2, se la considera implicada en la fase intracelular referida a infecciones sistémicas.

El sistema de secreción TTSS, también está presente en otras bacterias patógenas e incluso en E. coli enteropatógeno y enterohemorrágico. Este sistema de secreción tiene similitudes con la maquinaria de secreción y ensamblaje de los flagelos en E. coli y Salmonella. Bacterias gram negativas, han adaptado al menos dos orgánulos de superficie para la liberación de

macromoléculas por un mecanismo dependiente de contacto celular, en

E. coli existe el de tipo III y el tipo IV : tipo de “conjugación adaptada”. Sistemas

que requieren de sistemas auxiliares tipo chaperona para la exportación de sustratos utilizando a la maquinaria de transferencia : un sistema inyector respectivo para cada tipo de secresión , permitido el transporte en un solo paso a través de un canal transmembrana. Para Salmonella además del tipo III y IV existe el tipo VI (Blondel et al, 2009).

El sistema de secreción tipo IV, comprendida también de proteínas “transportadoras” que son utilizadas por algunas proteínas de bacterias patogénicas gram negativas. Su función diferencial es la exportación de largas cadenas ácidos nucleicos, DNA (Christie y Vogel, 2000). Todas éstas proteínas secretadas por esta ruta tienen un dominio β en el extremo carboxilo, el cual se piensa que forma un canal de láminas β anfipáticas y antiparalelas en la membrana externa a través del cual pasa el dominio α. En la mayoría de los casos, la unión entre los dominios α y β de la preproteína es procesada proteolíticamente. El dominio α puede ser liberado extracelularmente o asociado de forma no covalente al dominio β. La inserción del dominio β dentro de la membrana se cree que ocurre espontáneamente (Brandon y Goldgerg, 2001; Henderson y Nataro, 2001). En bacterias del Gn. Salmonella la estructura

del sistema inyector de las proteínas de virulencia del sistema tipo IV se asemejan a los de tipo VI (solo demostrado en el Gn. Salmonella), a diferencia que el tipo SSTT tipo VI carecen de ciertas proteínas estructurales presentes en la membrana externa.