E coli necrotoxigénica (NTEC)

En el año 1983 se descubre una toxina en aislamientos de E. coli asociados a diarrea aguda en niños (menores de 2 años). Dicha toxina produjo necrosis en la piel de conejo y causó alteraciones morfológicas en los cultivos celulares (HeLa, Vero y CHO). Debido a estas características, los autores la denominaron factor necrotizante citotóxico (CNF) (cytotoxic

necrotizing factor) (Caprioli et al., 1983). El término NTEC (necrotoxigenic E. coli) se utiliza

para designar a las cepas de E. coli capaces de elaborar CNF (Nagy et al., 2005). Por lo tanto, las cepas productoras de CNF1 se denominan NTEC-1, mientras que aquellas productoras de CNF2 se designan NTEC-2 (De Rycke et al., 1999; Nagy et al., 2005).

b) Factores de virulencia y genes codificantes

Diferentes estudios describen la obtención de aislamientos NTEC a partir de terneros con enteritis, diarrea (Blanco et al., 1988; De Rycke et al., 1990; Pohl et al., 1993; Burns et al., 1996) y septicemia (Mainil et al., 1999; Van Bost et al., 2001b) o de bovinos adultos y terneros sin diarrea (Burns et al., 1996; Blanco et al., 1998).

80 i) Toxinas CNF

La toxina CNF es una proteína (115 kDa) (Blanco y Blanco, 1993) que produce necrosis en la piel de conejo (Blanco et al., 1988; De Rycke et al., 1990), tiene efecto letal en ratones

luego de la inoculación por vía intraperitoneal y causa multinucleación en las células HeLa (De Rycke et al., 1990) o en otras líneas celulares (Vero, CHO, MA-104 y Hep-2) (Blanco y

Blanco, 1993). Las toxinas CNF activan a las proteínas Rho, una pequeña familia de GTPasas cuya función es regular el citoesqueleto. Por lo tanto, estas toxinas producen una modificación del citoesqueleto celular que conduce a la formación de haces grandes de filamentos de actina (fibras de estrés). Además, la toxina CNF facilita que las células puedan ingerir partículas de látex y bacterias al entrar en contacto con la membrana. La activación de las proteínas Rho también acelera la síntesis de ADN y estimula el ingreso en la fase S del ciclo celular (De Rycke

et al., 1999).

En un estudio se evaluaron las propiedades tóxicas de los extractos celulares de E. coli

aisladas de animales y humanos. En el mismo De Rycke y cols propusieron los nombres de CNF1 y CNF2 para identificar a las toxinas (De Rycke et al., 1990). Comparando la actividad de ambas, CNF2 produjo una mayor necrosis en la piel de conejo (100 veces más potente), tuvo una mayor actividad letal en ratones inoculados (100%) y fue la única toxina que causó necrosis en la planta del pie de ratones (De Rycke et al., 1990). En cambio, CNF1 fue más potente para inducir la multinucleación en células HeLa (De Rycke et al., 1999). La toxina CNF1 causa multinucleación, agrandamiento (10 veces el tamaño) y redondeamiento de las células HeLa, mientras que la toxina CNF2 causa multinucleación de menor magnitud, elongación, polimorfismo y pérdida parcial de la viabilidad celular (De Rycke et al., 1990; Blanco y Blanco, 1993). Los ensayos de neutralización con antisueros específicos para cada toxina indican que existe cierto grado de neutralización cruzada entre ambas (De Rycke et al., 1990).

La toxina CNF1 está codificada por un gen cromosómico, mientras que el gen codificante para CNF2 se ubica en plásmidos (ej. pVir) (De Rycke et al., 1999). Los análisis de las secuencias deducidas de aa para ambas toxinas (1014 aa) indican un 84% de similitud (De Rycke

et al., 1999). Los aislamientos NTEC de terneros se caracterizan por producir CNF2 (Burns

et al., 1996; Blanco et al., 1998; Orden et al., 1999, Van Bost et al., 2001b), independientemente

de la condición clínica del animal (Burns et al., 1996). Las cepas NTEC-2 se pueden recuperar a partir de las heces (Burns et al., 1996; Blanco et al. 1998; Orden et al., 1999) o de sitios extraintestinales (Burns et al., 1996; Mainil et al., 1999; Van Bost et al., 2001b). La frecuencia

81 relativa de NTEC-1 en la MF de terneros diarreicos y sanos o en sus órganos es mucho menor (Burns et al., 1996; Blanco et al., 1998; Orden et al., 1999).

ii) Fimbrias y otras toxinas asociadas a CNF

Las cepas NTEC causantes de septicemia e ITU en humanos muestran una asociación evidente entre CNF1, α-hemolisina (Hly) y fimbria P (Pap), la cual también se confirmó a nivel molecular. Un análisis detallado demostró que los genes cnf1, hly y prs (adhesinas de la fimbria P) se ubican en una isla de patogenicidad (PAI-5) (110 kb) cromosomal (De Rycke et al., 1999). Estas características también se confirmaron en las cepas NTEC-1 bovinas aisladas de casos de diarrea y septicemia. El 96% de las mismas fueron hemolíticas y la asociación entre Hly y Pap se observó en el 69% de las cepas (Mainil et al., 1999).

El plásmido Vir de los aislamientos NTEC-2 presenta genes codificantes para CNF2, F17b y Afa. Las cepas NTEC-2 positivas a F17 tienen la capacidad de adherirse de manera específica a la vellosidad intestinal del ternero y el 53% de las cepas productoras de CNF2 presentan F17 (Oswald et al., 1991). Con respecto a las variantes de F17, el 56% de las cepas NTEC-2 tienen F17b, mientras que F17c y F17d se identificaron con menor frecuencia (22% cada una) (De Rycke et al., 1999). El plásmido Vir también expresa CDT-III, un miembro de las toxinas de distensión citoletal (CDT, citolethal distending toxin) (Nagy et al., 2005). Estas toxinas producen un bloqueo irreversible del ciclo celular en la etapa G2/M, el cual se atribuye al mantenimiento de una forma inactiva del factor promotor de la mitosis (MPF) (De Rycke et al., 1999). Además, las cepas NTEC-2 de origen fecal o asociadas a infecciones extraintestinales se caracterizan por producir aerobactina (5% y 70%), resistir a la actividad bactericida del suero (50% y 79%) o expresar ambas propiedades en forma conjunta (41% y 50%), aunque sólo raramente causan hemolisis en agar sangre (De Rycke et al., 1990; Oswald et al., 1991).

En Bélgica, una investigación caracterizó las cepas NTEC aisladas de terneros con septicemia o diarrea. Las cepas NTEC-2 asociadas a septicemia (26 cepas) resultaron positivas a CDT (100%), F17 (69%) y Afa-VIII (69%), mientras que sólo muy pocas cepas fueron positivas a Pap (7%). En cambio, todas las cepas NTEC-1 septicémicas (4 cepas) resultaron positivas a la combinación Pap/Sfa. Con respecto a las cepas NTEC (sin especificar variantes) aisladas de casos de diarrea (35 cepas), las mismas presentaron genes codificantes para CDT (57%), Afa- VIII (62%), Pap (43%) y F17 (31%) (Van Bost et al., 2001b). En otro trabajo se analizaron cepas NTEC de 6 países (Bélgica, Canadá, Francia, Irlanda, Italia y España), las cuales se aislaron de terneros con septicemia y diarrea. El 65% de las cepas NTEC-2 fueron positivas para F17 y/o Afa; los genotipos de estas cepas incluyeron F17 (38%), Afa (14%) y F17/Afa (13%). Por otra

82 parte, las cepas NTEC-1 presentaron genotipos muy distintos a los de las cepas NTEC-2, ya que el 80% presentó Pap y/o Sfa (Mainil et al., 1999).

c) Prevalencia de NTEC

En España se evaluó la frecuencia de NTEC en terneros y bovinos adultos (Blanco et al., 1988; Blanco et al., 1998). La detección de las toxinas se realizó por cultivo en líneas celulares (HeLa y Vero) (Blanco et al., 1988; Blanco et al., 1998) y el resultado (efecto citopático) se

confirmó mediante las pruebas de necrosis en la piel de conejo y letalidad en ratones (Blanco

et al., 1988) o por PCR (Blanco et al., 1998). La prevalencia de NTEC fue del 18% (14/78) en

terneros menores a 30 días de vida y con diarrea, los cuales procedían de 13 granjas ubicadas en La Coruña (Blanco et al., 1988). Posteriormente, un estudio realizado en Galicia determinó una prevalencia del 58% (53/90) para NTEC-2 en terneros sin diarrea y menores a 4 meses de vida; sólo 1 ternero resultó positivo a NTEC-1. La frecuencia de aislamientos NTEC en vacas fue mucho menor (18%; 47/268) con respecto a los terneros (p < 0,001) y la mayoría de estos animales (17%) eran portadores de NTEC-2. En dicho trabajo se concluyó que las cepas NTEC-2 colonizan el intestino del ganado bovino y tienen una amplia distribución en los rodeos bovinos, ya que pueden encontrarse en el 95% de las granjas (Blanco et al., 1998).

En otro estudio llevado a cabo en Irlanda se evaluó la presencia de NTEC en bovinos. La detección de CNF se realizó por cultivo celular (HeLa) y seroneutralización (Burns et al., 1996). La frecuencia de NTEC-2 fue mayor en los terneros sin diarrea (31%; 35/113) con respecto a los diarreicos (19,3%; 43/223). La detección de NTEC-1 fue mucho menor y similar en ambos grupos de terneros (4,4% y 4%, respectivamente). La mayor proporción de bovinos infectados con cepas NTEC-2 se observó, principalmente, en los terneros menores a 4 semanas de vida y sin diarrea (57,1%) (Burns et al., 1996).

En general, los serogrupos de NTEC son muy diversos. En una colección de cepas NTEC-2 (57 cepas), aportada por diferentes investigadores de 7 países, se estableció que los serogrupos más frecuentes fueron O2 (26,3%), O8, O75, O78 y O141 (7% cada uno). En cuanto a las cepas NTEC-1 (45 cepas), las mismas se clasificaron dentro de los serogrupos O2 (37,5%), O8 (12,5%), O11, O15, O78 y O83 (8,3% cada uno) (Mainil et al., 1999).

d) Patogenia

En un experimento se inocularon por vía oral terneros recién nacidos y parcialmente calostrados con las cepas B20a (CNF2+, F17c y F17d, aerobactina) y 1404 (CNF2+, F17b aerobactina). La diarrea se presentó a las 24 y 31 hpi (rango 11-40 hpi) y tuvo una duración

83 de 18 h (rango 5-53 h), aunque muchos terneros continuaban con diarrea al momento de la eutanasia (9/14 terneros). La mayoría de los animales inoculados a las 6 h de vida manifestaron decaimiento, falta de apetito, deshidratación (7/11), signos respiratorios (2/11) y se encontraron moribundos (3/11) al momento de la eutanasia. La excreción fecal de las cepas NTEC-2 coincidió con el inicio de la diarrea (o la antecedió por 4 h) y persistió por 19,5 h (rango 4-46 h), hasta el momento de la eutanasia. El número de cepas NTEC-2 durante el pico de excreción fecal fue variable (108,6 – 1011,8 UFC/ml) y su recuento no mostró una relación con la severidad de la enfermedad. Estas cepas también se recuperaron en un elevado número (106 – 109 UFC/ml) a partir de las distintas porciones de intestino. En cuanto a los sitios extraintestinales, las cepas NTEC-2 se aislaron de sangre (6/14 terneros), pulmón (6/14) e hígado (6/14); algunos terneros (5/8) presentaron aislamientos simultáneos en 2 o 3 sitios. Este trabajo confirmó que las cepas NTEC-2 fueron capaces de colonizar la mucosa intestinal y causar diarrea en terneros. Además, estos animales manifestaron signos de infección bacteriana generalizada y la obtención de

aislamientos a partir de sangre y órganos internos demostró su carácter invasivo (Van Bost

et al., 2001a).

En otro trabajo similar se infectaron terneros (6 h de vida) parcialmente calostrados con distintas cepas NTEC-2, las cuales fueron modificadas genéticamente para evaluar la importancia de los diferentes factores de virulencia. En la cepa 1404 se hicieron mutaciones alélicas de los genes cnf2 (1404∆CNF2) y cdt-III (1404∆CDT-III), mientras que la cepa H209 (pVir) se generó por conjugación del plásmido Vir entre la cepa 1404 y una cepa receptora no patógena de humano (H209). Los ternos desafiados con las cepas H209 (pVir) y 1404∆CDT-III desarrollaron diarrea (20-32 hpi) y la misma persistió hasta la eutanasia (44 y 91 hpi). El comienzo de la excreción de las cepas precedió en 8-12 h (grupo 1404∆CDT-III) o coincidió (grupo H209 (pVir)) con el inicio de la diarrea. En cambio, sólo un ternero (1/4) inoculado con la cepa 1404∆CNF2 manifestó diarrea (36 hpi), pero este animal presentó una infección natural por RV. Los recuentos de las cepas fueron similares, tanto en el intestino delgado (de 106,6 – 109 UFC/ml) como en el intestino grueso (de 108,2 – 109 UFC/ml). Además, las 3 cepas se pudieron aislar de pulmón e hígado. Esta investigación demostró que los factores de virulencia presentes en el plásmido Vir confieren propiedades patógenas a E. coli. La toxina CNF2 tendría un rol como causa de diarrea, pero no participó en el desarrollo de la bacteriemia. La pérdida de cnf2 en la cepa 1404∆CNF2 se asoció a una reducción en su patogenicidad, ya que los terneros no desarrollaron diarrea, pero mantuvo su capacidad para invadir diferentes órganos internos (Van Bost et al., 2003).

84 e) Lesiones

En los terneros infectados experimentalmente con cepas NTEC-2 se observó congestión y engrosamiento de la mucosa intestinal, principalmente a nivel de yeyuno e íleon. Además, se apreció un aumento en el tamaño (hipertrofia) de los linfonódulos mesentéricos (Van Bost et al., 2001a; Van Bost et al., 2003). Las lesiones histológicas más relevantes incluyeron atrofia de vellosidades y presencia de un importante infiltrado (neutrófilos, linfocitos y plasmocitos) en la mucosa del intestino delgado. Las criptas intestinales presentaron necrosis y los vasos linfáticos de la mucosa estaban distendidos (Van Bost et al., 2001a; Van Bost et al., 2003). En los linfonódulos mesentéricos se observó una activación de los nódulos linfoides y la presencia de neutrófilos desde los sinusoides corticales hasta la médula (Van Bost et al., 2001a; Van Bost

et al., 2003). En la mucosa del ciego y colon se observó un infiltrado compuesto por linfocitos y

neutrófilos; a nivel de las criptas hubo necrosis en algunos terneros (Van Bost et al., 2001a). En el pulmón se detectaron neutrófilos y linfocitos a nivel del intersticio o en el lumen alveolar y bronquiolar, acompañado de congestión y edema interalveolar (Van Bost et al., 2001a; Van Bost

et al., 2003). El bazo de algunos terneros presentó activación de la población de linfocitos, los

cuales se encontraban entrelazados con neutrófilos. En el hígado se observaron infiltrados de células inflamatorias (linfocitos y neutrófilos) y hemorragias, aunque no en todos los terneros (Van Bost et al., 2001a; Van Bost et al., 2003).

f) Diagnóstico de NTEC

Si bien CNF1 y CNF2 ejercen efecto citopático en distintas líneas celulares, es conveniente utilizar la línea HeLa para detectar las toxinas y posteriormente confirmar el resultado por seroneutralización (De Rycke et al., 1990). También se puede emplear la prueba intradérmica en conejos, la cual ha demostrado tener una mayor sensibilidad que la prueba de letalidad en ratones (Blanco et al., 1988). Posteriormente, se desarrolló una técnica de PCR con oligonucleótidos específicos. Esta última no sólo establece el genotipo de la toxina (cnf1 y cnf2)

sino que también muestra una excelente correspondencia con el ensayo in vitro en células HeLa. Esta PCR tuvo un 100% de sensibilidad y especificidad para identificar y caracterizar

correctamente a 107 cepas NTEC-1 (CNF1+) y 133 cepas NTEC-2 (CNF2+) (Blanco et al., 1996).