Comparació amb resultats obtinguts utilitzant el metanol com a única 

metanol com a única font de carboni 

En molts dels casos trobats a la bibliografia, els autors utilitzen el metanol com a única font de carboni al treballar amb P. pastoris sota el promotor AOX. En treballs

previs realitzats amb el fenotip Muts per a la producció de ROL utilitzant el metanol com a única font de carboni en l’etapa d’inducció, on aquest es manté fixat en 0.5 g l-1, el valor de qp màxim obtingut és 2 vegades superior a l’obtingut utilitzant els substrats mixtes, per a les mateixes condicions, però cal destacar, que aquest valor disminueix fins arribar a zero, a les poques hores d’inducció (Cos et al., 2006a). Per contra, la qp

substrats mixtes, ja que en aquest cas, el valor de la qp es manté gairebé estable durant tot el procés, i no es presenta cap aturada.

Quan el metanol va ser utilitzat com a única font de carboni, els valors màxims de productivitat i rendiments es van obtenir al treballar a la consigna de 1 g l-1, i al augmentar (1.75 g l-1) o al disminuir (0.5 g l-1) aquesta (taula 5.3), els valors relacionats amb la productivitat disminuïen significativament (Cos et al., 2006a). Quan s’introdueix

el sorbitol com a cosubstrat i es manté la consigna de metanol en 2 g l-1, els resultats obtinguts de Yp/x són similars, però al comparar els valors de productivitat especifica i volumètrica, s’obtenen millores de 1.3 vegades. Aquestes millores probablement es troben relacionades amb l’augment de la µ a l’utilitzar el sorbitol com a cosubstrat (0.004 vers 0.02 h-1).

Cal destacar que al treballar amb substrats mixtes, no es presenta la fase de latència d’aproximadament 20 h obtinguda per Cos et al., (2006a), abans no es registren nivells

d’activitat lipolítica significatius (més de 50 UA ml-1_{), ja que amb el sorbitol a les} poques hores d’inducció, s’obtenen valors d’activitat per sobre d’aquest valor (figura 5.6 A). També, els valors registrats de qp màxima a les dues condicions òptimes són similars (sobre 440 UA g-1 l-1), tot i que a l’utilitzar l’estratègia amb substrats mixtes, el valor de qp és manté durant tota la fase de producció, mai registrant valors inferiors a 200 UA g-1 l-1, arribant a zero a l’utilitzar el metanol com a única font de carboni. Al comparar els valors mitjans obtinguts de qp, es pot veure que el valor mitja d’aquest durant la fase d’inducció, a l’utilitzar substrats mixtes és 2.2 vegades superior ( 326.1 vers 148 UA g-1 l-1) que a l’utilitzar únicament el metanol.

Referent a la qsMet, quan el metanol va ser utilitzat com a única font de carboni (Cos

et al., 2006a), el valor mitjà d’aquest paràmetre durant la fase de producció var ser

similar, independentment de la consigna de metanol amb la que es va treballar (al voltant de 0.027 g g-1 h-1). D’altra banda, a l’utilitzar l’estratègia de cultiu, utilitzant substrats mixtes, el valor de la qsMet mitjana obtinguda és superior en totes les condicions utilitzades (taula 5.6), degut a l’efecte sinergètic de l’ús mixte de substrats. Per tant, el sorbitol, sembla que presenta un efecte positiu sobre consum de metanol.

Es poden observar més diferencies significatives entre la utilització de substrats mixtes i la utilització de metanol com a única font de carboni, ja que Cos et al., (2006a),

presenta la millor producció per a la consigna de metanol de 1 g l-1, però en aquestes condicions la qsMet mitjana és inferior que per a la resta de condicions utilitzades. Per contra, els experiments realitzats en aquest capítol, la qsMet mitjana, presenta una clara relació amb la producció de ROL (figura 5.8), presentant els valors més elevats de qsMet mitjana, en les condicions on la producció és màxima.

Cal destacar que prèviament Cereghino i Cregg (2000), treballant amb P. pastoris

demostren que els nivells de transcripció inicials del promotor AOX1 poden augmentar entre 3 i 5 vegades al treballar en condicions limitants de metanol, a diferència de treballar amb excés de metanol en el medi de cultiu. Alhora Cos et al., (2006a), troben

que indirectament els seus resultats confirmen el treball realitzat pels primers autors, ja que mitjançant l’anàlisi del pendent que presenta la qp durant les primeres hores d’inducció (2h), es pot realitzar un anàlisi indirecte de la producció de ROL. Aquests autors, troben que quan la concentració és de 0.5 g l-1_{, el pendent registrat durant les} primeres hores d’inducció, és 5 vegades superior que al treballar a 1 g l-1 (106 versus 20.5 UA gX-1 h-2). D’altra banda, al incloure el sorbitol com a cosubstrat, el major pendent registrat en la qp durant les primeres hores d’inducció, es troba quan la concentració residual del metanol en el medi de cultiu es troba a 2 g l-1 (100 UA gX-1 h- 2_{), disminuint al treballar a 0.5 g l}-1 _{(40 UA gX}-1 _h-2_{) i a 4 g l}-1 _{(50 UA gX}-1 _h-2_{). Per tant} la utilització del sorbitol com a cosubstrat, ha permès treballar obtenint velocitats màximes d’inducció similars a les obtingudes utilitzant el metanol com a única font de carboni a la consigna de 0.5 g l-1. Però alhora presenta una altra millora en el procés de producció, disminuint de forma important l’aturada de la producció obtinguda després de registrar el valor màxim, sota aquestes condicions de treball.

D’altra banda, és necessària la realització d’estudis relacionats amb els nivells de transcripció dels enzims involucrats en el procés de producció, per tal de veure si tal com determinen Cereghino i Cregg (2000), els nivells de transcripció dels enzims implicats són superiors al treballar a baixes concentracions de metanol residual. Tot i així, inicialment tot sembla indicar que la utilització del sorbitol com a cosubstrat, presenta avantatges en el procés de producció, no fent-se evident aquesta afirmació, ja que el pendent registrat en la qp durant les primeres hores d’inducció, és 2.5 vegades

superior al treballar a 2 g l-1 en comparació amb mantenir la concentració de metanol a 0.5 g l-1 utilitzant el sorbitol com a cosubstrat. Alhora és important tenir present que els valors obtinguts del pendent de la qp durant les primeres hores d’inducció al mantenir la consigna a 2 g l-1, és similar a l’obtinguda per Cos et al., (2006a), al treballar a la

consigna de 0.5 g l-1 de metanol. Per tant, a l’utilitzar el sorbitol, s’obtenen pendents similars, el que es podria traduir a nivells de transcripció similars, però en el cas del sorbitol, aquests es mantenen no arribant a bloquejar el sistema d’expressió observat en el cultiu de Cos et al., (2006a).

Estudis realitzats per Marx et al., (2006), posposen que en P. pastoris, la sobre-

expressió de ROL potencia la UPR (unfolded protein response). La UPR s’activarà a l’acumular-se proteïnes mal plegades en el reticle endoplasmàtic. En la mateixa línia de treball, Resina et al., (2007) demostren que la sobre-expressió i secreció de ROL

mitjançant P. pastoris sota el control del promotor PFLD1, indueix l’activació de la

UPR. De la mateixa forma, l’elevada qp obtinguda a l’inici dels cultius quan el metanol va ser utilitzat com a única font de carboni, sota el control del promotor AOX1, pot provocar l’acumulació de proteïnes mal plegades o un volum excessiu de proteïna, el qual pot resultar en estrès cel·lular, considerant-se aquesta una de les possibles causes de l’aturada de la qp a les poques hores d’inducció. Per tant, es podria dir que aquest problema amb l’ús del sorbitol com a cosubstrat es minimitza, ja que el valor de la qp durant la fase d’inducció es manté gairebé constant presentant una lleugera disminució, però mai arribant a valors de zero. Tot i que, seran necessaris, tal i com s’ha comentat prèviament, estudis dels nivells de transcripció dels enzims involucrats per tal de poder fonamentar aquesta informació, i així poder veure la influència del sorbitol com a cosubstrat sobre els nivells d’activació de la producció de ROL.