Capítulo I: Caracterización de la actividad de la DAGK, en sinaptosomas de CC
7.3 Comparación de la actividad de la DAGK sobre sustratos de diferente composición
La gran avidez por el sistema para transformar el SAG, fue llamativa. Una pregunta surgía de estos estudios y era si en verdad la actividad de la DAGK de sinaptosomas en las condiciones ensayadas, preferencialmente utilizaba el SAG como sustrato respondiendo a una actividad del tipo de la DAGK épsilon ó si el DPG, al ser un lípido altamente saturado, era incapaz de disolverse adecuadamente en el sistema micelar utilizado. Por tal motivo, decidimos ensayar la actividad enzimática en presencia de 1,2- dioleoilglicerol (DOG), que al poseer un cierto grado de insaturabilidad, es más soluble que el DPG. El ensayo se realizó a 4 mM de ATP, para asegurar la saturabilidad con respecto al co-sustrato y en presencia de concentraciones crecientes de DAG hasta 1 mM, comparando los tres DAG entre sí: el SAG, el DOG y el DPG.
Como podemos observar en la Fig. 23, a pesar de que la actividad enzimática en presencia de DOG, es superior que en presencia de DPG, la DAGK sinaptosomal utiliza preferencialmente el SAG en este sistema experimental. Ha sido reportado que la DAGKζ, quien utiliza otros DAGs insaturados muestra preferencia por DOG (Thirugnanam y col., 2001). Este resultado también indicaría que no se trata de la isoforma DAGK zeta, apoyando la hipótesis de que se trataría de la DAGKε.
Capítulo I
Fig. 23- Ac ti vidad D AGK u tilizando S AG, D OG y D P G como sust r atos lipídi cos y en presencia de 4 mM de ATP
Se utilizaron concentrac iones crecientes de DPG, DOG y SA G hasta 1 mM en presencia de 50 m M de OG. La concentración de A TP utili zad a fue de 4 m M, utili zand o como precursor radiactivo A TP-[γ-3 2P ] a razón de 8 µ Ci por mues tra. La reacción se inició con el agregado de la suspensión de membrana synaptosomal d urante 5 min de reacción a 37 ºC, p revi a sonicación durante 15 s egundos a fin de int rodu cir el A TP a los sinaptos omas.
7.3.1 Estudio de la actividad DAGK en las distintas fracciones subcelulares de corteza cerebral de rata.
Como se mencionó en la introducción, las distintas isoformas de la DAGK se distribuyen diferencialmente a nivel de tejido y a nivel subcelular, siendo el SNC el tejido en donde se expresan la mayoría de las isoformas descriptas hasta el momento. Ha sido reportado que la DAKε está presente en las membranas del retículo endoplásmico (RE) (Goto y col., 2008). Nuestro sistema experimental, para el estudio de la DAGK, comprende a los terminales sinápticos obtenidos de neuronas de la corteza cerebral y del hipocampo. Dichas preparaciones purificadas muestran en su interior las estructuras subcelulares características, mitocondrias, vesículas sinápticas y una proporción escasa aunque presente, de retículo endoplasmico. Una
Capítulo I
hipótesis que surgía a partir de la marcada actividad de la DAGK en presencia de SAG, era que si mayoritariamente medíamos en los sinaptosomas una actividad principalmente debida a la DAGKε, entonces el porcentaje de distribución de la actividad sería similar en presencia de ambos sustratos. Además la actividad medida sería menor en los sinaptosomas que sólo contienen en su interior una porción del RE con respecto a la fracción del SPMit que contiene la fracción de RE de la célula neuronal.La Fig. 24 representa la distribución porcentual de la actividad medida en las fracciones sinaptosomal, nuclear y sobrenadante post-mitocondrial provenientes CC de ratas adultas de 4 meses en presencia de DPG ó SAG. Si bien en presencia de SAG, la actividad enzimática medida fue aproximadamente 7 veces superior que en presencia de DPG, la distribución porcentual para ambos sustratos permaneció invariable.
Como se puede observar, la actividad DAGK en sinaptosomas de CC representa el 10,91 % de la actividad total, sin embargo el porcentaje de distribución en el SPMit es de un 72,9 %. Estos hallazgos sugieren, en coincidencia con lo reportado, que esta actividad observada se debe a la isoforma épsilon de la DAGK, presente en la fracción que contiene al retículo endoplásmico. La actividad hallada en la fracción sinaptosomal purificada se hallaría en la porción de retículo presente en el terminal sináptico. En el Capítulo II se presentan estudios de MF con anticuerpo contra DAGKε, donde se muestra la localización intrasinaptosomal de la enzima Fig. 49.
Capítulo I
Fig. 24- Dist ribució n de la activida d de la D AGK en distin tas fra cciones de CC de ratas ad ultas
Las distintas fracciones subcelulares se obtuvieron de acuerdo a lo detallado en Materiales y Métodos, Fi g. 4. La concentración d e DP G y SA G fue de 25 0 µ M en p resencia de 50 m M de OG. La concentración de A TP utilizada fue de 500 µ M, utili zando como precursor radiacti vo A TP-[γ-3 2P] a ra zón de 3 µ Ci por muestra . La reac ción se inició con el agregado de la suspensión de membrana synaptosomal durante 5 min de reacción a 37 ºC, previa sonicación du rant e 15 segundos a fin de i ntroducir el A TP a l os sinaptosomas.
Los valores expresan las actividades m edidas en cada fracción en pm oles de PA/m g proteínas, indicando en paréntesis el porcentaje de distribución en cada caso.
En este Capítulo se presentan los resultados de los estudios realizados para determinar la participación de la DAGK en la vía de señalización de la insulina en el SNC. Para evaluar la acción de la insulina, los sinaptosomas fueron incubados en presencia de ATP-[γ-3 2P], utilizando como sustrato
lipídico el DAG endógeno. Este tipo de ensayo depende de la disponibilidad del DAG generado a partir de los fosfolípidos de la membrana por acción de distintas vías enzimáticas (PLD/PAP2, PC-PLC, PI-PLC).
Para independizarnos de las variaciones del sustrato endógeno, que puede aumentar por actividades fosfolipásicas, también se evaluó el efecto de la insulina sobre la actividad de la DAGK, utilizando sustrato DAG radiactivo en micelas con DMSO al 0,1% v/v.
La figura 25A muestra que la insulina incrementa la formación de PA a partir del DAG endógeno en un 73% respecto al control, mientras que el incremento es del 46% a partir del DAG exógeno (DAG radiactivo). Bajo estas condiciones, también fue posible observar la metabolización del DAG radiactivo empleado, evaluando el MAG y el glicerol como producto soluble. La figura 25B representa la relación entre la actividad DAGK (PA-[3H]) y la
actividad hidrolítica (DAG lipasa y MAG lipasa), midiendo el MAG-[3H] y el
glicerol-[3H], respectivamente. Como se puede observar en la Fig. 25B, la