Tras una búsqueda exhaustiva en la literatura, hemos recopilado (Tabla. 1 de la introducción) información sobre mutantes de genes que afectan al desarrollo de la clavícula en el ratón. No obstante, ninguno de ellos posee el mismo fenotipo que el mutante Prdm16, aunque sí muestran algunas características comunes.
En el caso de los mutantes de Pbx1, se observa una hipoplasia de los elementos más proximales del esqueleto apendicular, incluida la clavícula. Este factor de transcripción forma complejos de unión de DNA con Meis proporcionando especificidad de unión para algunos factores de transcripción como las proteínas Hox, aunque también se ha descrito que estos complejos Pbx/Meis pueden modificar la estructura de la cromatina y favorecer así la unión de otros activadores específicos de la transcripción; un ejemplo de esto se da en la unión de MyoD al promotor de miogenina, al que previamente se unen estos dos factores para hacerlo competente a la transcripción (ver previews Developmental Cell, 2004 and (Berkes et al., 2004). Recientemente, se ha descrito que Meis se une a Pbx en el promotor de Hoxb1 de pez cebra impidiendo la entrada de histona-deacetilasas que modifican la estructura de la cromatina y bloquean la transcripción (Choe et al., 2009).
Prdm16 posee un dominio PR homólogo al dominio SET de ciertas proteínas de Drosophila implicado en la remodelación de la cromatina y, por tanto al igual que Meis, podría unirse a Pbx1 para posibilitar la transcripción de genes implicados en el desarrollo de la clavícula. Esto explicaría por qué, a pesar de expresarse en todo el mesénquima de la extremidad, Prdm16 sólo afecta a estructuras proximales, ya que la interacción de Meis con Pbx1 provoca la traslocación de éste último al núcleo únicamente en la parte proximal de la extremidad. En un trabajo muy reciente se demuestra la implicación de Prdm16 en el mantenimiento de las células madre hematopoyéticas, función con la que también se ha relacionado a Pbx1 y a Meis, lo cual también apoyaría la hipótesis de una posible interacción de estos tres factores de transcripción (Azcoitia et al., 2005; (Ficara et al., 2008; Aguilo et al., 2011).
La falta de función de los genes de la familia Aristalles también presentan ciertas similitudes con el fenotipo del ratón Prdm16-/-. Así el doble mutante de Alx3/Alx4 muestra, al igual que éste, defectos craneofaciales y una fuerte hipoplasia clavícular. En ambos casos, la parte más afectada de la clavícula es la parte medial (parte cercana al esternón) que se encuentra ausente tanto en el primero como en los segundos. Sin embargo, en los mutantes Alx3/Alx4 aunque también tienen afectada la parte distal de la mandíbula y el cierre del paladar, tienen intactos los huesos del oído medio y el anillo timpánico, una diferencia importante con los mutantes PRDM16.
Alx3 y Alx4 poseen funciones redundantes en el desarrollo de la clavícula, ya que los mutantes individuales no impiden la formación de esta estructura. También Cart1, otro gen homólogo a Aristalles, parece cooperar con ellos en la formación de la clavícula ya que el doble mutante Alx4/Cart1 tiene una hipoplasia mayor en este hueso que el doble mutante Alx3/Alx4, de manera que Cart1 parece tener un papel más importante que Alx3 en este contexto. Si además de interrumpir la función de los genes Alx3 y Cart1, prescindimos del gen Tbx15 se produce agénesis clavicular. En estos mutantes también se ha observado hipoplasia en la escápula lo cual concuerda con la bajada de expresión del gen Pax1 en la parte anterior del esbozo de la extremidad; este gen marca la condensación de la escápula y la articulación acromioclavicular. No se sabe con estos datos si los genes de la familia aristalles también afectarían a la condensación de la clavícula al igual que hacen con la escápula. (Beverdam et al., 2001; Kuijper et al., 2005). La expresión Pax1 en la parte anterior del mesénquima de la extremidad es coherente con estudios de linaje que demuestran que el mesénquima anterior da lugar a las estructuras más proximales (Vargesson et al., 1997). A pesar de esto, no se conoce ningún marcador de la condensación de la clavícula en estadíos tempranos.
Por lo tanto, se puede concluir que estos cuatro genes (Alx3,Alx4, Cart1 y Tbx15) contribuyen al mismo proceso durante la formación de la clavícula, aunque no se conoce la fase del desarrollo de este hueso que estaría afectada en los mutantes.
Tbx5, es el único gen implicado en la inducción de la extremidad, sin el cual no se desarrolla ningún elemento apendicular incluida la clavícula. Éste se expresa en la placa lateral mesodérmica, en la zona prospectiva de la extremidad anterior, y por tanto, podría ser un buen candidato que iniciase la formación de la condensación mesenquimal de la clavícula. Existen varios tipos de mutantes condicionales que anulan la función de Tbx5 en el dominio de expresión de Prx1 (gen que se expresa desde muy temprano en todo el mesénquima de la extremidad). El primero que se realizó era una línea Tbx5 lox/lox;Prx1 Cre en la que la recombinasa Cre induce la recombinación en el locus de Tbx5, anulando así la función del gen en todas las células que expresen Prx1 En este caso el fenotipo era una desaparición total de la extremidad, incluida la clavícula (Rallis et al., 2003). Posteriormente se hizo una modificación de esta línea que consistía en introducir una recombinasa Cre inducible por tamoxifeno que permitía un control temporal de la interrupción del gen. De esta manera, la recombinación en el total de las células de la extremidad se conseguía en un estadío posterior a la inducción de la extremidad (E9,5). En estos mutantes el AER y la ZPA se forman correctamente pero el esbozo de la extremidad es más fino en el eje AP debido a una reducción del mesénquima anterior. Además, la ausencia de Tbx5 también provoca la disminución de Sall4, factor de transcripción cuya expresión se restringe a esta parte del mesénquima. Este fenotipo está en concordancia con la hipoplasia de algunos elementos esqueléticos proximales en estadíos más tardíos como la escápula, que presenta un agujero en su parte más ancha (Hasson et al., 2007).
La hipoplasia escapular también se observa en los mutantes de Tbx15, Alx4 y Cart1, que, como ya hemos mencionado anteriormente, están implicados en la formación de la clavícula. Teniendo en cuenta que estos genes se expresan más tarde que Tbx5 en la placa lateral mesodérmica podrían estar por debajo de este gen en la cadena molecular que regula el desarrollo de este hueso.
El hecho de que el mutante condicional de Tbx5 regulado por tamoxifeno no tenga afectada la clavícula, indica que el papel de Tbx5 en el desarrollo de esta estructura se realiza antes ó en el momento de la inducción de la extremidad. El mutante de Prdm16 posee una truncación severa de la clavícula, y también una ligera hipoplasia en la escápula parecida a la del mutante de Cart1 y los dobles mutantes Cart1/Alx4 y Cart1/Alx3. No obstante, el Prdm16 se expresa antes de la inducción de la extremidad en la placa lateral mesodérmica, al igual que el Tbx5, mientras que los demás se inducen más tarde, con lo que podría estar por encima de estos genes en la jerarquía molecular que controla la
Dada la coincidencia espacio-temporal del patrón de expresión de Tbx5 y Prdm16 en el campo de la extremidad, sería interesante estudiar si existe algún tipo de conexión entre estos dos genes.
Existen otros mutantes individuales que suprimen ó afectan a la formación de la clavícula. Un ejemplo son los mutantes del gen Runx2, cuya mutación en heterocigosis es la causante del síndrome humano denominado Cleidocraneal displasia (CCD) en humanos. A pesar de que se han descrito ciertos casos de agénesis total de la clavícula ó desaparición de la parte medial, en la mayoría de los individuos afectados la parte más afectada es la parte lateral que conecta con el acromion, que, en individuos que tienen la patología, presenta una osificación rudimentaria; en algunos casos no muy numerosos falta un fragmento de clavícula entre la parte lateral y la parte medial, lo cual también se observa en los ratones neonatos deficientes en el factor de transcripción Prdm16. El modelo de ratón que reproduce este síndrome también posee malformación de la clavícula, aunque el resto del fenotipo es diferente al del Prdm16.
El fenotipo de la CCD afecta a huesos craneales como los huesos parietales, mientras que el PRDM16-/- no presenta un fenotipo aparente en esta parte de la cabeza. A pesar de que ambos genes afectan a distintos huesos craneofaciales no podemos descartar que no tengan funciones parcialmente solapantes ó que se encuentren en la misma ruta de señalización durante la osteogénesis endocondral en algunos huesos como la clavícula.
Otro de los genes con fenotipos parecidos pero no iguales al mutante Prdm16 es el mutante del gen AP-2, que codifica para un factor de transcripción inducible por ácido retinoico. Los ratones que carecen de este gen poseen agénesis de la clavícula, apertura de la pared abdominal y algunos defectos craneofaciales ligados a defectos en poblaciones de cresta neural; entre ellos se encuentra la ausencia de huesos del oído medio y el anillo timpánico, lo cual es interesante ya que es el único gen descrito con anomalías en la clavícula y anillo timpánico al igual que el PRDM16. Además el ácido retinoico es importante para la formación de los elementos proximales de la extremidad (Mercader et al., 2000). Sin embargo, estos mutantes, tampoco forman el esternón, con lo cual no se sabe si el fenotipo de la clavícula es un efecto primario ó secundario de la mutación de este gen.
Conclusiones
Conclusiones
Conclusiones
• El análisis transcriptómico de la población de precursores de la extremidad a distintos
estadios de su desarrollo proximodisal ha permitido el aislamiento de un elevado número de genes de formación de patrón implicados en el desarrollo de la extremidad de vertebrados, como certifica el enriquecimiento en genes homeobox, clásicamente relacionados con este proceso. Además, de los 30 genes analizados experimentalmente, un 70% tenían una expresión significativa en la extremidad, y un 56% una expresión restringida en esta estructura. Para al menos 8 de los genes estudiados, no había sido descrita su expresión y función en la extremidad.
• La quimioquina CXCL14 tiene una expresión altamente específica y dinámica a lo largo del
desarrollo de la extremidad de ratón y de pollo. En el primero, la distribución del mRNA que codifica esta proteína marca un dominio mesenquimal totalmente nuevo correspondiente a una subpoblación celular del tejido conectivo no estudiada previamente, que también aparece en pollo a estadios tardíos. En ambas especies esta quimioquina posee una fuerte expresión ectodérmica.
• CXCL14 presenta una expresión no solapante y en muchos casos complementaria a la de
SDF1, la única otra quimioquina con tan alta conservación evolutiva. Es especialmente
llamativa la alta complementariedad de ambas tanto en la extremidad de ratón como en la de pollo.
• La sobreexpresión de CXCL14 en el mesénquima de la extremidad de vertebrados no afecta a
la expresión de marcadores específicos de precursores de tendones y de músculo, y tampoco al crecimiento de la vasculatura en las condiciones experimentales desarrolladas en esta tesis.
• El factor de transcripción Prdm16 se expresa en la placa lateral mesodérmica, en la zona
prospectiva de la extremidad anterior, antes de la inducción de la extremidad, y por todo el mesénquima de esta estructura durante la embriogénesis. Además, esta proteína se expresa también de manera prominente en el mesénquima craneofacial y tejido nervioso.
• Los ratones mutantes Prdm16 -/- poseen defectos craneofaciales y en el tronco arterial del
• Los ratones mutantes Prdm16 -/- poseen defectos en los elementos proximales de la
extremidad (escápula y clavícula) compatibles con un papel en la formación de patrón en su eje proximodistal.
• La pérdida de función del factor de transcripción PRDM16 provoca agénesis de la parte
medial de la clavícula, que, en contraposición con la parte lateral de osificación membranosa, se forma por osificación endocondral.
• Estudios histológicos de marcadores específicos de hueso y cartílago, demuestran que la
clavícula tiene un programa de condrogénesis y osteogénesis especial que no se observan en ningún otro hueso del cuerpo, y que su parte medial se desarrolla a partir de un cartílago primario.